Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação de Soluções
- Prepare 500 mL de líquido cefalorraquidiano artificial padrão (ACSF) contendo os componentes descritos em nosso trabalho publicado, conforme listado na Tabela 1.
- Use copos de vidro limpos com água deionizada para preparar uma solução ACSF fresca. Limpe as espátulas com água deionizada e seque antes de usar para adicionar cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), fosfato de di-hidrogênio e sódio (NaH2PO4), bicarbonato de sódio (NaHCO3), sulfato de magnésio (MgSO4), D-glicose e adicione o cloreto de cálcio (CaCl2) após ter borbulhado a solução com 95% O2 / 5% CO2mistura por ~ 20 min (conforme detalhado na Tabela 1) a 500 mL de água deionizada. Mexa até dissolver totalmente.
- Certifique-se de que o ACSF esteja completamente limpo, sem qualquer precipitação. Em seguida, ajuste o pH para 7,2-7,4. Bolha com uma mistura de gases composta por 95% de O2 e 5% de CO2 por ~20 min.
- Prepare 250 ml de solução para cortar fatias contendo os produtos químicos descritos no quadro 2.
- Adicionar KCl, cloreto de magnésio (MgCl2), NaH2PO4, NaHCO3, colina·Cl e D-glicose e adicionar o cloreto de cálcio (CaCl2) por último, conforme indicado em 1.1.1, a 250 ml de água desionizada e dissolver conforme descrito em 1.1.1 e 1.1.2.
- Depois de borbulhar com 95% de O2/5% de CO2, coloque a solução em um freezer por 15-20 min para que a solução de corte fique gelada e parcialmente congelada.
nota: Usamos esta solução de corte ao fazer fatias de camundongos de 1 a 2 meses; A fórmula pode ser diferente para camundongos com mais de 2 meses.
- Prepare uma solução de lipopolissacarídeo (LPS) dissolvendo-a em solução salina isotônica estéril livre de endotoxinas (NaCl a 0,9%). O LPS é administrado por via intraperitoneal (0,5 mg/kg) e começa a registrar 2 h depois.
2. Preparação do corte do córtex pré-frontal
- Retire a solução de corte do freezer e homogeneize para obter uma lama. Coloque a solução no gelo e borbulhe constantemente com 95% O2/5% CO2.
- Usando uma tesoura grande e afiada, decapite rapidamente um rato conforme descrito e imediatamente coloque a cabeça em um copo cheio de solução de corte gelada (0-4 ° C).
- Corte a parte superior do crânio ao longo da linha média na direção caudal-nasal com uma tesoura fina e remova as porções laterais do crânio. Remova o cérebro com uma espátula fina e coloque em uma solução de corte gelada.
nota: As etapas 2.2-2.3 devem ser executadas rapidamente (idealmente < 1 min).
- Coloque o cérebro na tampa de uma placa de Petri de 9 cm cheia de gelo. Enxágue o cérebro com uma solução de corte gelada. Corte o cerebelo e o bulbo olfatório com uma lâmina de barbear.
- Aplique cola de cianoacrilato no suporte da amostra de um vibratome. Coloque cuidadosamente o bloco cerebral na gota de cola, com o lado rostral para cima, e mergulhe imediatamente na solução de corte gelada.
- Ajuste o porta-lâmina do vibratomo em um ângulo de 15° em relação ao plano horizontal e prepare fatias de cérebro coronal de 350 μm (frequência de vibração da lâmina = 85 Hz, velocidade = 0.1 mm/s).
- Com uma pipeta, transferir as fatias para a câmara de recuperação cheia de FCA, incubar durante 1 h (a RT) com borbulhamento constante de 95% O2/5% CO2.
3. Gravação de patch de célula inteira
- Faça micropipetas de borossilicato de vidro para uso como eletrodos de gravação ou micropipetas de sopro de acordo com as diretrizes específicas do Manual de Operação do Exapultor. Para o registro de eletrodos, as resistências da ponta estão na faixa de 4-6 MΩ, enquanto as micropipetas de sopro têm diâmetros de ponta na faixa de 2-5 μm.
- Adicione bloqueador do canal de Na+ (Tetrodotoxina (TTX), 1 μM), para bloquear o canal rápido de Na+ e, portanto, os potenciais de ação, ao ACSF e mantenha uma taxa de fluxo constante desta solução de 2-3 mL / min na câmara de registro, por bomba peristáltica para dentro da câmara e aspiração para fora dela. Borbulhe o ACSF com 95% O2/5% CO2 constantemente para garantir a viabilidade das fatias.
- Transferir uma fatia de cérebro para a câmara de registo utilizando uma pipeta de Pasteur modificada cuja ponta fina foi cortada de acordo com o tamanho da fatia. Cubra a fatia com uma âncora de platina com fios de nylon paralelos espaçados ≥2 mm para segurar a fatia na plataforma.
- Encha a micropipeta de registro com solução interna (Tabela 3) e encha as micropipetas de sopro com ácido gama-aminobutírico (GABA) a 10 μM, 50 μM e 100 μM (dissolvido em ACSF) ou ACSF como controle do veículo.
- Para evitar o bloqueio com detritos, aplique uma leve pressão positiva usando uma seringa de 1 mL antes de imergir o eletrodo de registro no ACSF. Usando um micromanipulador sob um microscópio (lente objetiva 4x), posicione o eletrodo de gravação e a micropipeta de sopro de forma que as pontas apareçam no centro da imagem de vídeo no monitor (Figura 1A).
- Ajuste o foco do microscópio (lente objetiva de 40x) enquanto abaixa gradualmente a micropipeta de sopro e coloque-a acima do neurônio de registro em um ângulo de 45°. Mantenha a distância entre a ponta da micropipeta de sopro e o neurônio registrada entre 20-40 μm (Figura 1B). Aproxime-se lenta e cuidadosamente do neurônio com o eletrodo de registro e, em seguida, libere a pressão positiva. Aplique uma sucção fraca e breve através da tubulação conectada ao suporte do eletrodo para criar uma vedação de giga-ohm.
- Mantenha a tensão em 0 mV. Após a formação da vedação giga-ohm, compense a capacitância rápida e lenta manualmente ou automaticamente. Em seguida, aplique uma sucção breve e forte através do tubo mencionado acima para entrar no modo de célula inteira.
- Registre o eIPSC no modo de grampo de tensão. Aplique baixa pressão de gás (nitrogênio, 4 - 6 psi) à micropipeta de sopro usando um Picospritzer controlado por um gerador de passo de tensão Master 8 para fornecer sopros de GABA simples ou emparelhados (Figura 2).
Tabela 1. Gravação ACSF.
| substância | g/mol | Concentração (mM) | Peso (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6.9547 |
| Kcl | 74.551 | 2.5 | 0,1864 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1 | 0,1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26.2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0,1565 |
| D-glicose | 198,17 | 11 | 2.1799 |
| CaCl2 | 110,98 | 2.5 | 0,2775 |
Tabela 2. Solução de corte de fatias.
| substância | g/mol | Concentração (mM) | Peso (g/L) |
| Kcl | 74.551 | 2.5 | 0,1864 |
| MgCl2 | Nº 95.211 | 7 | 0.6665 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1.25 | 0,1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2,1002 |
| Colina·Cl | 139.63 | 115 | 16.0575 |
| D-glicose | 198,17 | 7 | 1,3872 |
| CaCl2 | 110,98 | 0,5 | 0,0555 |
Tabela 3. Solução interna para gravações de adesivos de células inteiras.
| substância | g/mol | Concentração (mM) | Peso (g/L) |
| Gluconato de Cs | 328.052 | 100 | 32.8052 |
| CsCl | 168,36 | 5 | 0.8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2,3830 |
| MgCl2 | Nº 95.211 | algarismo | 0,1904 |
| CaCl2 | 110,98 | 1 | 0,1110 |
| BAPTA | Nº 476.433 | 11 | 5.2408 |
| Na2ATP | 551.1 | 4 | 2.2044 |
| Na2GTP | 523,2 | 0,4 | 0,2093 |
