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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Soluções externas e internas
- Use a solução de Ringer de mamíferos durante a dissecção da retina e como solução externa no registro eletrofisiológico subsequente. Prepare a solução de Ringer em mamíferos a partir de solução estoque 10x (sem cálcio) no dia do registro e adicione CaCl2 gota a gota após 15 min de carbogenação (95% O2 e 5% CO2). A solução final 1x contém (em mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2HPO4, 0,1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 e 10 D-glicose.
- Use duas soluções internas para caracterizar as oscilações do SAC. Testar a utilidade das soluções preparadas em registos prolongados de grampos de retalho de células inteiras em células ganglionares da retina (RGCs) de ratinhos adultos e armazenar os lotes verificados em alíquotas de 500 μl a -20 °C até à utilização.
- Para registrar a oscilação do potencial de membrana, use uma solução interna à base de potássio que contenha (em mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4 trifosfato de adenosina (ATP)-Mg, 0,5 trifosfato de li-guanosina (GTP), 5 ácido etilenoglicol tetracético (EGTA), 10 ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) e 0,2% de biocitina (p/v). Ajuste o pH para 7,3 com KOH.
- Para registrar correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias, use uma solução interna à base de césio que contenha (em mM): 100 Cs-metanossulfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% de biocitina (p / v). Ajuste o pH para 7,3 com CsOH.
2. Preparação para o Dia da Gravação
- Para preparar uma membrana de nitrocelulose com orifícios abertos, perfure manualmente a membrana com um perfurador personalizado feito de uma agulha de seringa 16 G embotada e alise a membrana entre duas placas de vidro limpas. Para uma retina de montagem completa, faça um orifício central de 0,2 mm de diâmetro e envolva-o por 4 orifícios maiores de 1 a 1,2 mm de diâmetro.
- Para fazer um filamento de aterro personalizado para carregar a solução interna em eletrodos, derreta uma ponta de pipeta de 10 μl no meio e alongue suavemente a porção derretida até que esfrie e endureça. Pouco antes de usar, use uma lâmina de barbear limpa para aparar o filamento até que fique um pouco mais longo do que as pipetas de remendo.
- Puxe pipetas de conexão em um extrator programável de tubo de vidro de borossilicato com um filamento interno. Fabricar as micropipetas no dia do experimento e utilizá-las imediatamente.
nota: Para gravação de SACs, usamos a seguinte configuração do extrator: calor: 484; puxar: 0; velocidade: 25; tempo de atraso: 1; Pressão: 400 e um valor de rampa de 462. O diâmetro externo (OD) e o diâmetro interno (ID) dos tubos de borossilicato são 1,65 mm e 1,0 mm, respectivamente. A resistência das pipetas é de 10-14 MΩ.
- Uma hora antes da colheita do tecido, descongele um tubo de solução interna agitando-o em um vórtice por >30 min.
3. Dissecção da retina
- Anestesiar o animal com isoflurano a 4% em oxigênio até que o animal perca a capacidade de resposta a uma pitada no dedo do pé. Sacrifique o animal por luxação cervical.
- Corte os dois globos oculares dos nervos ópticos a 1-2 mm de distância das cabeças dos nervos ópticos com uma tesoura de íris de ponta reta.
- Role os globos oculares em uma toalha de papel limpa para remover o sangue e, em seguida, mergulhe-os na solução de Ringer de mamíferos carbogenados. Faça um furo no limbo com uma agulha 23 G e corte os globos oculares cortando ao longo do limbo com uma microtesoura. Remova a córnea e o cristalino usando uma pinça fina.
- Para montagem total da retina, retire suavemente toda a retina do epitélio pigmentado com uma pinça fina e faça quatro cortes ortogonais de 1,5-2 mm da borda em direção à cabeça do nervo óptico.
- Mergulhe uma membrana de nitrocelulose perfurada no prato e arraste suavemente a retina sobre ela com a camada de células ganglionares (GCL) voltada para cima. Coloque a cabeça do nervo óptico no orifício central ao preparar uma retina de montagem completa. Transfira a membrana com a retina para outro prato limpo. Alise suavemente a retina com um pincel fino para parecer uma cruz de Malta e coloque as quatro bordas sobre os orifícios.
- Se uma fração da retina for examinada de cada vez, corte cada ocular preparada na Etapa 3.3 em 3-4 pedaços com uma lâmina de barbear com o epitélio pigmentado preso. Proteja as peças não utilizadas da luz em solução externa carbogenada e use-as dentro de 12 horas.
- Seque a membrana de nitrocelulose com um pedaço de papel de filtro seco e remova a membrana vítrea e limitante interna com uma pinça e um pincel.
- Certifique-se de que todas as bordas da retina estejam totalmente presas à membrana antes de transferir o conjunto para a câmara de gravação com uma lamínula de vidro selada na parte inferior. Prenda a membrana com graxa a vácuo na lamínula e reidrate a retina com a solução externa. Tenha cuidado para não prender bolhas de ar embaixo do conjunto.
- Coloque a câmara no palco de um microscópio vertical. Perfundir a câmara com solução externa carbogenada quente (34-35 °C) a uma taxa de ~3 ml por minuto.
- Examine a retina sob uma lente objetiva de 10x primeiro e, em seguida, use uma lente de imersão em água de 60x para ver os neurônios GCL e da camada nuclear interna (INL) sob contraste de interferência diferencial (DIC) e / ou epifluorescência. Para visualizar SACs que expressam tdTomato, use uma fonte de luz de diodo emissor de luz branco (LED) em combinação com um filtro de excitação de 554 nm e um filtro de emissão de 581 nm.
4. Gravação de grampo de patch de célula inteira de Retina de montagem plana
- Filtre a solução interna através de um filtro de seringa no filamento de aterro personalizado.
- Insira o filamento em uma micropipeta recém-puxada e distribua a solução interna perto da ponta até que a solução cubra o fio de eletrodo de prata por >5 mm. Prenda a micropipeta em um porta-eletrodo com uma haste de sucção, através da qual a pressão dentro do eletrodo pode ser ajustada empurrando ou puxando o êmbolo de uma seringa de plástico de 10 ml conectada ao tubo.
- Encontre a pipeta sob a objetiva e baixe-a para ~ 100 μm acima da retina. No modo seguidor de corrente (I = 0), use o deslocamento CC para zerar o sinal de tensão CC permanente. Meça a resistência da pipeta no modo de pinça de corrente (IClamp) injetando correntes de onda quadrada de amplitude fixa através da pipeta enquanto ela está no banho e neutralize a diferença girando o botão Raccess. Use a leitura no botão Raccess para calcular a resistência da pipeta pela lei de Ohm.
- Lentamente, leve o eletrodo a ~ 10 μm acima da retina. Aplique pressão positiva ao eletrodo. Observe a mudança de reflexão perto da ponta da pipeta à medida que se aproxima da retina. Forçar rápida mas suavemente a pipeta para dentro do GCL e reduzir imediatamente a pressão positiva.
- Mova a pipeta em direção a um neurônio marcado. Evite entrar em contato com outros neurônios, vasos sanguíneos e pés finais das células de Muller. Aplique mais pressão positiva, se necessário, para evitar o entupimento do eletrodo.
- Posicione a ponta da pipeta perto da linha média de um neurônio marcado até que uma covinha seja visível. Libere a pressão positiva e permita que a membrana plasmática volte para a ponta da pipeta.
- Aplique correntes negativas de 20 a 120 pA na pipeta para ajudar na formação de uma vedação de giga-ohm. Aplique uma sucção suave, se necessário, para puxar a membrana plasmática para dentro da pipeta. Aguarde 5 minutos após a formação do selo para romper a membrana celular. Isso permite que a solução interna derramada seja eliminada por superfusão. Rompa a membrana por uma sucção suave.
- Após a ruptura da membrana e enquanto estiver no modo de grampo atual, ligue o equilíbrio da ponte e ajuste-o usando o botão Raccess.
nota: Para uma célula pequena como o SAC, apenas um pequeno ajuste é necessário, se houver. Alternativamente, registre as correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias no modo de pinça de tensão (V Clamp) mantendo a célula em potenciais de reversão de cloreto (cerca de -75 mV) e glutamato (cerca de 0 mV), respectivamente. Verifique e ajuste a posição da pipeta, se necessário, para acomodar desvios ocasionais da retina e/ou do micromanipulador.
- Para registrar o potencial de membrana ou a mudança de corrente antes, durante e após o tratamento farmacológico, prepare bloqueadores sinápticos (por exemplo, cianquixalina [CNQX], (2R)-amino-5-fosfonopentanoato [AP5], picrotoxina, tubocurarina, etc.) e moduladores de canal (por exemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenâmico, etc.) frescos no dia do experimento a partir de estoques congelados. Dilua os medicamentos com solução de Ringer carbogenada. Aplique-os em lote por perfusão.
- Após a gravação, remova suavemente a pipeta do soma. Transfira o conjunto da câmara para um prato limpo. Retire e recoloque a retina em outra membrana de nitrocelulose achatada sem furos para garantir o nivelamento da retina durante a fixação.