Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Montagem de fatias de tecido da medula espinhal em MEAs
- Aqueça o meio nutriente estéril na incubadora (37 °C, tampa levemente desenroscada para oxigenação).
- Posicione o feixe de vários eletrodos ou MEA com pinças estéreis com pontas revestidas de borracha à temperatura ambiente (RT) na placa de Petri sob um microscópio estéreo com o feixe de eletrodos em foco. Centralize uma gota de 6 μl de plasma de galinha no conjunto de eletrodos limpo, livre de poeira e estéril. Usando uma pequena espátula, deslize cuidadosamente duas seções da medula espinhal com os lados ventrais voltados um para o outro na gotícula de plasma. Não toque nos eletrodos com a espátula.
- Adicione 8 μl de trombina ao redor da gota de plasma de galinha. Usando a ponta da pipeta de trombina, misture cuidadosamente e espalhe a mistura de plasma de frango/trombina ao redor das duas fatias. Novamente, não toque diretamente no conjunto de eletrodos quebradiços. Imediatamente antes da coagulação, aspire o excesso de plasma/trombina de galinha.
- Tampe a placa de Petri para reter alta umidade enquanto o conjunto MEA/cultura permanece por cerca de 1 hora em uma câmara umidificada dentro da incubadora a 37 °C.
- Adicione cuidadosamente 10 μl de meio nutriente à câmara de cultura, tampe a placa de Petri e coloque de volta na incubadora por cerca de 30 min.
- Coloque cada conjunto MEA/cultura com pontas estéreis cobertas de borracha em um tubo de rolo, adicione 3 ml de meio nutriente e feche bem a tampa. Coloque o tubo do rolo no tambor de rolos, girando a 1 - 2 rpm na incubadora em uma atmosfera contendo CO5% 2 a 37 °C.
- Troque metade do meio nutriente após 7 dias in vitro (DIV) e depois 1 - 2 vezes por semana.
2. Lesões Mecânicas
- Retire o conjunto MEA/cultura com pontas estéreis cobertas de borracha do tubo do rolo e coloque em uma placa de Petri sem meio nutriente sob um microscópio estéreo com o tecido em foco. Verifique visualmente se as duas fatias estão fundidas.
- Segure o conjunto MEA/cultura com firmeza colocando pinças com pontas cobertas de borracha no MEA.
- Coloque uma lâmina de bisturi na ranhura do MEA perto das fatias de tecido. Segure o bisturi na horizontal.
- Levante o cabo do bisturi, mas deixe a lâmina do bisturi ficar na ranhura do MEA de forma que a lâmina "role" da base às pontas e, assim, corte o tecido que cobre a ranhura.
- Grave quaisquer conexões de tecido residual com uma ponta de agulha de 25 G, se necessário. Trabalhe apenas na área dentro da ranhura e não toque nas bordas macias.
- Coloque o conjunto MEA/cultura de volta no tubo do rolo. Forneça 3 ml de meio nutriente fresco às culturas e coloque-as de volta no tambor de rolos na incubadora.
3. Registros eletrofisiológicos da atividade espontânea
- Para investigar a regeneração funcional entre as duas fatias da medula espinhal após o número escolhido de DIV, monte o conjunto MEA/cultura em uma câmara de registro em um microscópio e aplique cerca de 500 μl de solução extracelular (ver lista de materiais).
- Aguarde 10 minutos antes da primeira gravação para permitir que o sistema se estabilize.
- Registre a atividade espontânea básica 2x por cerca de 10 min de cada eletrodo de detecção de atividade do MEA em RT.
- Para garantir condições extracelulares estáveis, troque a solução extracelular após cada sessão de gravação.
- Para desinibir a rede, aplique uma solução extracelular contendo estricnina (1 μM) e gabazina (10 μM). Aguarde pelo menos 2 minutos antes de iniciar a gravação.
4. Análise dos dados
NOTA: Para a detecção dos potenciais de ação registrados extracelularmente, use um detector baseado em desvios padrão e um discriminador subsequente para cada eletrodo.
- Exiba a atividade neuronal detectada de cada eletrodo em um gráfico raster de acordo com os procedimentos padrão (Figura 1F).
- Determine e exiba a atividade total da rede para cada fatia resumindo o número de eventos nos canais apropriados em uma janela deslizante de 10 ms, deslocada em etapas de 1 ms (Figura 1G).
- Detecte em cada fatia rajadas individuais (grupos de atividade que aparecem em vários eletrodos). Portanto, defina um limite mínimo de atividade de pico na atividade total de rede correspondente e defina cada início e fim de intermitência. Por exemplo, um limite apropriado é 25% da amplitude média de intermitência, e um início de intermitência pode ser definido como sendo o primeiro evento em uma janela de tempo de pelo menos 5 ms e um fim de intermitência sendo o último evento em uma janela de tempo de pelo menos 25 ms.
- Para quantificar a regeneração funcional, calcule a porcentagem de rajadas sincronizadas entre as duas fatias. Para fazer isso, calcule a latência entre uma intermitência em uma fatia e a intermitência seguinte na outra fatia.
nota: Um par de intermitência é denominado "sincronizado" quando a latência é menor que o comprimento médio da intermitência. Especialmente em co-culturas com muita atividade, existe a possibilidade de que ambos os lados coincidentemente iniciem uma explosão na janela de latência escolhida. Este fato deve ser levado em consideração na quantificação da porcentagem de rajadas sincronizadas.
