Excitação externa de culturas neuronais padronizadas unidimensionais

Resumo

Fonte:Stern, S., et al. Excitação externa de neurônios usando campos elétricos e magnéticos em culturas unidimensionais e bidimensionais. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra uma técnica para estimular culturas neuronais padronizadas por linha com um campo elétrico uniforme e unidirecional.

Protocolo

1. Imagem da atividade espontânea ou evocada em culturas neuronais com corantes fluorescentes.

1. Preparar uma solução de 50 μg de corante fluorescente sensível ao cálcio (ver quadro de materiais/reagentes) em 50 μL de DMSO (dimetilsulfóxido).
2. Prepare a solução de registro extracelular (EM) contendo (em mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glicose, 45 sacarose (pH 7,4).
3. Incubar a cultura neuronal em 2 mL EM com 8 μL da solução de corante fluorescente sensível ao cálcio por 1 h. Proteger da luz e girar suavemente para garantir uma disseminação homogênea do corante para as células.
4. Substitua a solução por EM novo antes da imagem. A imagem fluorescente é demonstrada na Figura 1.
5. Imagem em microscópio de fluorescência com filtros ópticos para imagens de fluorescência de cálcio (pico de excitação em 488 nm, pico de emissão em 520 nm), utilizando câmera e software capazes de quantificar a intensidade de qualquer região de interesse (ROI) dentro do campo de visão do microscópio.

2. Estimulação Elétrica de Culturas

NOTA: A configuração básica para estimulação elétrica é mostrada na Figura 2. Uma lamínula na qual a cultura neuronal foi cultivada por cerca de 14 dias é colocada em uma placa de Petri sob um microscópio de fluorescência. A atividade elétrica dos neurônios é visualizada usando corantes sensíveis ao cálcio, enquanto uma voltagem é aplicada por meio de dois pares de eletrodos de banho posicionados fora da cultura. Os eletrodos são acionados por um gerador de sinal cuja saída é amplificada por um amplificador de canal duplo. O controle de tensão para estimulação é preferível ao controle de corrente mais padrão, porque os vetores de campo elétrico são determinados diretamente, permitindo assim a adição e combinação direta de vetores. Isso requer uma verificação cuidadosa da uniformidade do campo elétrico, que pode ser realizada em toda a amostra para o caso de controle de tensão. Ao usar o controle de tensão, deve-se tomar cuidado para evitar loops de aterramento e a homogeneidade do campo elétrico deve ser verificada.

1. Para estimulação elétrica com um campo elétrico homogêneo, use um par de fios de eletrodo paralelos.
   1. Use eletrodos de platina com espessura da ordem de 0.005'' (127 μm). Quando usado com as lamínulas de 13 mm, certifique-se de que a distância entre os dois eletrodos seja de cerca de 11 mm e posicione os eletrodos 1 mm acima da cultura.
      NOTA: Para fazer o porta-eletrodo (Figuras 3A), use politetrafluoretileno (PTFE). Faça furos estreitos através do PTFE para inserir os eletrodos. O dispositivo deve ser mais alto do que a solução extracelular para que a extremidade superior, onde os eletrodos estão expostos, nunca entre em contato com a solução. Para isolamento, use cola epóxi em qualquer parte dos fios do eletrodo que possa estar exposta.
   2. Use uma forma de pulso quadrado com um ciclo de trabalho de 50%, sem componente DC para evitar eletrólise. Varie a duração do pulso entre 10 μs e 4 ms para causar estimulação eficaz sem queimar a cultura. Certifique-se de que a amplitude seja da ordem de ± 22 V (consulte a Figura 3). O pulso quadrado pode ser observado em um osciloscópio conectado em paralelo aos eletrodos.
      nota: Para facilitar a programação de qualquer forma de onda desejada, use um software comercial de edição de formas de onda (consulte a lista de materiais). Insira graficamente a forma de onda desejada e envie-a para o gerador de formas de onda.
2. Para testar a homogeneidade do campo, use um eletrodo de sonda. Use uma grade de pelo menos 1 mm x 1 mm para permitir que a sonda seja movida na área entre os eletrodos e medir o potencial elétrico.
   1. Meça o potencial elétrico. Use para calcular o campo elétrico. Use um dos eletrodos como eletrodo de referência. Meça o campo elétrico com durações de pulso variáveis entre 100 μs e 4 ms (consulte a Figura 3B para obter um exemplo de duração de pulso de 100 μs) para verificar se o campo é homogêneo dentro da faixa de durações de estimulação.
      nota: Veja a Figura 3D para um exemplo de homogeneidade de campo elétrico medida quando a duração do pulso foi de 1 ms.

Resultados

Figura 1: Exemplos de traços de transientes de cálcio fotografados durante rajadas de rede síncronas. Uma imagem de neurônios que foram tingidos antes do experimento com um corante de cálcio. B. Traços de intensidade vs. tempo das ROIs em A com a cor do traço representando a cor da borda da ROI em A. Um grande aumento na intensidade sincronizada dentro das três ROIs representa uma ex...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de cálcio, 1M	Fluka	Rolamento 21098	Solução de gravação extracelular.
D-(+)-glicose, 1M	Sigma-Aldrich	Nº 65146	Meio de galvanização, solução de gravação extracelular.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Solução de gravação extracelular.
KCl, 3M	Merck	1049361000	Solução de gravação extracelular.
Cloreto de magnésio, 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Solução de gravação extracelular.
NaCl, 4M	Bio-Laboratório	19030591	Solução de gravação extracelular .
Sacarose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Solução de gravação extracelular.
Fios de eletrodos	Sistemas AM, Carlsborg WA	Rolamento 767000	Estimulação elétrica de culturas neuronais.
Gerador de sinal	BKPrecisão	Nº 4079	Modelagem do sinal elétrico.
amplificador	caseiro		Amplificação de tensão do sinal do gerador de sinal para os eletrodos.
fonte de alimentação	matriz	MPS-3005 LK-3	Fonte de alimentação para a máquina de pulverização catódica.
Fios de platina com 0,005'' de espessura; Sistemas AM,	Carlsborg WA	Rolamento 767000	Estimulação elétrica de culturas neuronais.