Estimulação de culturas neuronais padronizadas por um campo magnético

Resumo

Fonte: Stern, S., et al., Excitação externa de neurônios usando campos elétricos e magnéticos em culturas unidimensionais e bidimensionais. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra um método para estimular culturas neuronais cultivadas em um anel circular padronizado em uma lamínula, usando um campo magnético variável no tempo.

Protocolo

1. Preparação de lamínulas para culturas 1D.

1. Limpe as lamínulas de vidro por imersão em uma solução de base de piranha consistindo de 75 mL de DDW, 25 mL de solução de amônia a 25% e 25 mL de peróxido de hidrogênio a 30%. Coloque a solução com as lamínulas de vidro em uma placa de aquecimento a ~ 50 ° C por 30 min e, em seguida, seque as lamínulas de vidro com nitrogênio.
2. Primeiro, as lamínulas são revestidas com um fino filme de cromo (99,999%) de 6 Å de espessura, seguido por uma camada de ouro de 30 Å (99,999%), usando deposição de vapor ou pulverização catódica.
   1. Para atingir uma taxa de pulverização catódica de 0,05 – 1 Å /s, use uma máquina de pulverização catódica com 2 feixes eletrônicos e um sistema de vácuo de 260 l/s com tamanhos alvo de 2" e 4". Use um estágio de rotação que pode ir de 0 a 100 rodadas por minuto (RPM). Use uma potência de pulverização catódica de corrente contínua (DC) de 0 a 750 Watts.
   2. Para obter plasma a 10 mTorr de pressão na câmara, gire o dispositivo a 30 rpm e use argônio a 99,999%.
   3. Opere a fonte de alimentação das pistolas de pulverização catódica a uma potência de pulverização catódica de 40 W DC para o cromo, levando a uma taxa de cobertura de ~ 0.12 Å/s, e a uma potência de pulverização catódica de 10 W DC para o ouro, levando a ~ 0.28 Å/s.
3. Usando ultrassom por 30 min, dissolva 0,1 g de 1-octadecanetiol em 100 mL de etanol ABS AR. Colocar lamínulas revestidas com Cr-Au nesta solução durante 2 h, depois lavar com etanol ABS AR e secar com azoto.
4. Prepare uma solução de 100 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) e 3,5 g de um copolímero tribloco (ver Tabela de Materiais/Reagentes) agitando por 1 a 2 h a 600 a 700 rpm. Coloque lamínulas na solução por 1 h. Secar lamínulas com azoto.
5. Grave mecanicamente o padrão desejado arranhando a camada de bio-rejeição. Faça isso usando um plotter de caneta, onde a caneta é substituída por uma agulha de gravação. Risque o padrão através das camadas de metal para alcançar o vidro subjacente. Controle esse processo por um computador para obter um padrão desejado replicado. Os padrões formados por esse processo são demonstrados na Figura 1 e na Figura 2.
6. Prepare uma camada biocompatível de 100 mL D-PBS, 3,5 g de copolímero tribloco, 35,7 μL / mL de fibronectina e 29 μl / mL de laminina.
   1. Esterilize as lamínulas em luz ultravioleta por pelo menos 10 min. Incube as lamínulas na solução biocompatível preparada durante a noite.
      NOTA: A camada biocompatível se formará apenas onde a camada de biorrejeição tiver sido gravada na etapa anterior.
   2. No dia seguinte, lave as lamínulas duas vezes com P-DBS. Incube-os em PM durante a noite. As lamínulas estão agora prontas para o revestimento celular.

2. Manutenção das culturas neuronais.

1. Prepare o meio de mudança (CM) composto por (por mL): 0,9 mL MEM+3G, 0,1 mL HI HS, 10 μL 5-fluoro-2′-desoxiuridina (FUDR) com uridina 100x.
2. Prepare o meio final (FM) composto por (por mL): 0,9 mL MEM+3G e 0,1 mL HI HS.
3. Substitua PM por 1-1,5 mL de CM após 4 dias in vitro (DIV). Às 6 DIV, substitua 50% do CM por CM fresco. No DIV 8, altere o meio para 1,5 mL de FM, seguido de uma mudança de 50% de FM a cada 2 dias. Após cerca de uma semana, surge uma atividade síncrona espontânea.

3. Imagem da atividade espontânea ou evocada em culturas neuronais com corantes fluorescentes.

1. Preparar uma solução de 50 μg de corante fluorescente sensível ao cálcio (ver Tabela de Materiais/Reagentes) em 50 μL de DMSO (dimetilsulfóxido).
2. Prepare a solução de registro extracelular (EM) contendo (em mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glicose, 45 sacarose (pH 7,4).
3. Incube a cultura neuronal em 2 mL EM com 8 μL da solução de corante fluorescente sensível ao cálcio por 1 h. Proteja da luz e gire suavemente para garantir a disseminação homogênea do corante para as células.
4. Substitua a solução por EM novo antes da geração de imagens. A imagem fluorescente é demonstrada na Figura 3.
5. Imagem em microscópio de fluorescência com filtros ópticos para imagens de fluorescência de cálcio (pico de excitação em 488 nm, pico de emissão em 520 nm), utilizando câmera e software capazes de quantificar a intensidade de qualquer região de interesse (ROI) dentro do campo de visão do microscópio.

4. Estimulação Magnética de Culturas

Nota: A configuração básica para estimulação magnética é mostrada na Figura 1. No canto superior direito é mostrado um microscópio de fluorescência invertida que é usado para obter imagens de corantes sensíveis ao cálcio nos neurônios. A bobina magnética (círculos azuis) é posicionada cerca de 5 mm concentricamente acima de uma cultura de anel neuronal (contorno azul). Uma bobina de captação (círculo vermelho) na circunferência da placa de Petri monitora a tensão induzida pelo pulso magnético. No canto superior esquerdo é mostrada a dinâmica medida da bobina do estimulador magnético (MS) com uma carga de tensão do capacitor de 5.000 kV, integrada a partir da bobina de captação. O campo elétrico induzido (calculado para um raio de anel de 14 mm) é representado em verde, enquanto o campo magnético é representado em azul. Na parte inferior são mostradas imagens da cultura neuronal. No canto inferior esquerdo está uma imagem de campo brilhante de uma lamínula padronizada de 24 mm. As áreas brancas são os neurônios. O padrão fotografado consiste em culturas de anéis concêntricos com diferentes raios. No canto inferior direito está um zoom em um pequeno segmento dos anéis, mostrando neurônios individuais. Para uma escala, a largura dos anéis é de cerca de 200 μm.

1. Cultive os neurônios em um padrão de anel circular (gravado conforme descrito em 1.5) para estimulação de cultura 1D. Use um corante fluorescente sensível ao cálcio para imagens de cálcio (conforme descrito na seção 3) com uma cultura 1D padronizada em linhas finas (170 μm) e longas (10 mm).
   1. Use uma bobina magnética circular e posicione uma placa de Petri aproximadamente 5 mm abaixo e concêntrica com a bobina. Use uma bobina personalizada de aproximadamente 30 mm (diâmetro interno, diâmetro externo de 46 mm) com uma indutância de L = 90 mH acionada por um MS caseiro ou comercial carregado com uma tensão máxima de 5 kV.
   2. Para estimular magneticamente as culturas neuronais, uma alta voltagem e corrente são descarregadas através de uma bobina condutora usando um interruptor de alta corrente e alta voltagem. O estimulador magnético (MS) pode ser construído usando grandes capacitores, da ordem de 100 mF, para obter uma alta tensão de 1 - 5 kV. Como alternativa, use um MS disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais/Reagentes).
      nota: Use um fio de cobre retangular revestido de poliéster de 0,254 mm de espessura e 6,35 mm de largura para fabricar uma bobina caseira. Gire os fios em estruturas feitas sob medida, isoladas com fibras de vidro e fundidas em epóxi (consulte a Tabela de Materiais/Reagentes). Como alternativa, use bobinas disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais/Reagentes).

Resultados

Figura 1: Esquema da configuração usada para estimulação magnética de culturas neuronais. Na parte superior é mostrada a bobina magnética (círculos azuis), que está localizada 5 mm concentricamente acima da cultura do anel neuronal, colocada em uma placa de Petri (contorno azul). Uma bobina de captação (círculo vermelho) posicionada na circunferência da placa de Petri mede a tensão induzida pelo puls...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CaCl2 , 1M	Fluka	Rolamento 21098	Solução de gravação extracelular
D-(+)-glicose, 1M	Sigma-Aldrich	Nº 65146	Meio de galvanização, Solução de gravação extracelular
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Culturas de células
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Revestimento
Fluo4, AM	Tecnologias de vida	F14201	Imagem de atividade espontânea ou evocada
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Mudando de meio
Gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272	Meio de chapeamento, meio em mudança, meio final.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Solução de gravação extracelular
OI HS	bi	04-124-1A	Meio de revestimento, Meio em mudança, Meio final
KCl, 3M	Merck	1049361000	Solução de gravação extracelular
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Revestimento.
MEM x 1	Gibco	Rolamento 21090-022	Meio de revestimento, Meio em mudança, Meio final
Cloreto de magnésio, 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Solução de gravação extracelular
NaCl, 4M	Bio-Laboratório	19030591	Solução de gravação extracelular
Octadecanetiol	Sigma-Aldrich	1858	Limpeza de lamínulas revestidas com Cr-Au (culturas 1D)
Sacarose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Solução de gravação extracelular
Uridina	Sigma-Aldrich	U3750	Mudando de meio
Máquina de pulverização catódica	AJA Internacional, Inc	ATC Orion-5Series	Revestimento de vidro com finas camadas de metal
Plotter de caneta	Hewlett Packard	HP 7475A	Gravação do padrão na lamínula revestida
fonte de alimentação	matriz	MPS-3005 LK-3	Fonte de alimentação para a máquina de pulverização catódica
epóxi	Cognis	Versamid 140	Fundição de bobinas caseiras
epóxi	concha	EPON 815	Fundição de bobinas caseiras