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Medição da fisiologia sináptica viva com matrizes de multieletrodos (MEAs)
1. Preparar MEAs para cultura de células.
- Limpe a superfície de cada MEA com 1 mL de detergente por 1 h. Enxágue com água deionizada estéril (DI), enxágue com etanol 70% para esterilizar e, em seguida, seque ao ar em um gabinete de biossegurança sob luz ultravioleta.
nota: Os MEAs podem ser armazenados em água DI a 4 °C em condições estéreis até o uso.
- Prepare uma solução de 0,5 mg / mL de poliornitina (PLO) dissolvendo 50 mg de PLO em 100 mL de tampão de ácido bórico. Cubra a superfície de cada MEA com 1 mL de PLO para torná-lo hidrofílico e incube a 37 ° C por um mínimo de 4 h. Remova o PLO e lave a superfície com água DI.
- Diluir a solução de revestimento de matriz extracelular (MEC) com meio basal (DMEM/F12) para preparar uma solução-mãe de 1 mg/ml. Para uma solução de trabalho, ressuspenda 3 mL de estoque de ECM em 33 mL de meio DMEM/F12 pré-resfriado, elevando o volume total para 36 mL para uma concentração de 80 μg/mL.
- Adicionar 1 ml de solução de trabalho ECM a cada MEA e incubar a 37 °C durante um mínimo de 4 h.
- Remova o ECM e coloque as esferas em 1.5 mL de meio em uma superfície MEA, garantindo que as esferas estejam posicionadas no topo do feixe de eletrodos (Figuras 1A, 1A'). Deixe a mídia aderir por 2 dias. Troque metade da mídia a cada 2 a 3 dias (ou com mais frequência, se necessário), garantindo que as esferas não sejam perturbadas.
nota: A adição de fatores de crescimento pode melhorar a sobrevivência e a maturação da cultura.
2. Meça a atividade elétrica das esferas neurais.
- Configure um sistema de matriz de multieletrodos (MEA) com um headstage com temperatura controlada. Crie um programa de software com um filtro passa-alta de 5 Hz, um filtro passa-baixa de 200 Hz e um limite de pico de 5x o desvio padrão (SD).
- Coloque o MEA no cabeçote e registre a atividade elétrica espontânea (Figura 1B, B'). Salve dados brutos, incluindo frequência e amplitude de picos, para análise estatística.
nota: Um sistema de perfusão pode ser utilizado com o MEA para adicionar agentes farmacológicos ou para aumentar o fluxo de meios frescos para registro de longo prazo. Conforme desejado, pode ser realizado um pós-processamento adicional de picos.
