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1. Ablação de uma subpopulação de neurônios usando um microscópio a laser de dois fótons
NOTA: Se os usuários planejam realizar imagens de Ca após a ablação, use a linha UAShspzGCaMP6s. Se os usuários planejam realizar o registro comportamental após a ablação, use a linha UAS:EGFP, pois a ablação de células positivas para EGFP é mais fácil de realizar do que de células que expressam GCaMP6s.
- Comece configurando o acoplamento de uma linha Gal4 que rotula neurônios específicos a serem estudados e UAS:EGFP ou UAShspzGCaMP6s. Certifique-se de usar o fundo de nácar para ambos os pais para que os homozigotos de nácar possam ser obtidos.
nota: Os homozigotos de nácar não contêm melanóforos na superfície do corpo (Figura 1B). No presente estudo, são utilizadas uma linhagem Gal4 gSAIzGFFM119B (que marca o pretectum) e outra linha Gal4 hspGFFDMC76A (que rotula o ILH).
- No dia seguinte à configuração do acasalamento, colete os ovos de peixe-zebra e eleve-os ao estágio larval, momento em que os neurônios de interesse expressarão repórteres fluorescentes.
- Monte a larva do peixe-zebra em 2% de baixo ponto de fusão-agarose (Figura 1B).
- Comece preparando uma solução estoque de agarose a 2%: Dissolva 2 g de pó de agarose de baixo ponto de fusão em 100 mL de água do sistema (ou seja, a água usada para manter o peixe-zebra adulto em um sistema de circulação de água) ou água E3 aquecendo a água até o ponto de ebulição em um micro-ondas e misturando vigorosamente.
- Microondas o caldo de agarose de baixo ponto de fusão a 2% até ferver. Despeje 3,5-4,0 mL de agarose na tampa de uma placa de Petri de 6 cm. Espere até que a agarose esfrie para que fique quente ao toque antes de prosseguir.
- Em seguida, coloque uma única larva (não anestesiada nesta etapa) na agarose. Continue ajustando a posição e a orientação da larva para que fique em pé, usando uma agulha de dissecação (Figura 1C), até que a agarose solidifique para garantir o posicionamento adequado da larva.
nota: A larva continuará a nadar enquanto a agarose se solidifica.
- Assim que a larva estiver posicionada, aguarde 5 minutos para que a agarose solidifique completamente.
- Despeje 5 mL de solução de tricaína (0,4% na concentração de trabalho 1x) sobre a agarose.
nota: Para evitar movimentos das larvas durante a ablação a laser, as larvas devem ser mantidas anestesiadas durante todo o procedimento de ablação.
- Ablação da larva usando a função de branqueamento em um sistema de microscopia a laser de dois fótons.
- Coloque a larva embebida em agarose sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons e inicie o sistema de microscopia.
- Inicie o software de aquisição de imagem e clique no botão "On" na guia "Laser" para ligar o laser (Figura 1D). Aguarde até que o "Status" do laser mude de "Ocupado" para "Modo bloqueado".
- Na guia "Canais", defina o comprimento de onda do laser em 880 nm (potência máxima: aproximadamente 2,300 mW) para ablação EGFP ou em 800 nm (potência máxima: aproximadamente 2,600 mW) para ablação GCaMP.
- Selecione a lente objetiva 20X movendo manualmente o revólver da lente. Clique na guia "Localizar", clique em "GFP" para alterar os caminhos ópticos e visualize diretamente a fluorescência a olho nu.
- Localize o cérebro da larva do peixe-zebra no centro da visão; em seguida, clique na guia "Aquisição" para voltar à microscopia de dois fótons.
- Como um registro da condição 'antes da ablação', tire uma imagem z-stack com a lente objetiva 20X em velocidade de varredura rápida (para evitar danos causados pelo calor). Posteriormente, compare as imagens tiradas antes e depois dos experimentos de ablação (Figura 2A). Para obter uma pilha z, clique em "Z-Stack" para selecionar a opção z-stack e expandir a guia. Defina o limite inferior (clique no botão "Definir primeiro") depois de focar na extremidade ventral do cérebro larval e defina o limite superior (clique no botão "Definir último") depois de focar na superfície dorsal do cérebro. Em seguida, clique no botão "Iniciar experimento" para executar a aquisição de imagem z-stack.
- Selecione a lente objetiva 63X movendo manualmente o revólver da lente.
- Clique na guia "Localizar" para alternar para a microscopia epifluorescente, localize as células a serem ablacionadas no centro da visão a olho nu e, em seguida, clique na guia "Aquisição" para voltar à microscopia de varredura a laser.
- Na guia "Modo de aquisição", defina o "Tamanho do quadro" em 256 x 256. Clique em "Ao vivo" e observe os neurônios de interesse.
- Começando pelo lado mais dorsal, encontre um plano focal no qual as células a serem abladas estejam em foco.
- Marque uma pequena área circular com cerca de um terço do tamanho da célula em diâmetro em cada neurônio como uma região de interesse (ROI) usando a função "Regiões".
- Defina a velocidade de digitalização para 13,93 s/256 x 256 pixels (134,42 μm x 134,42 μm), o que corresponde a um tempo de permanência do laser de aproximadamente 200 μs/pixel ou 200 μs/0,5 μm. Além disso, defina 4 repetições ('Ciclo de iteração: 4'). Como alternativa, otimize o número de iterações e a velocidade de varredura para que a ablação suficiente seja alcançada.
- Execute a função 'Branqueamento' para ablação, em combinação com a 'Série temporal (2 ciclos)' para obter a imagem da amostra (antes e depois da ablação) e 'Regiões' (para definir os ROIs) ou funções equivalentes no software usado (Figura 1D).
- Ao comparar a primeira imagem (antes da ablação) e a segunda imagem (após a ablação) no ciclo da série temporal, certifique-se de que, após o branqueamento, a fluorescência nas células-alvo diminua para a observada no nível de fundo (Figura 2B).
- Se a fluorescência ainda estiver presente após a ablação, aumente o número de iterações.
- Em seguida, mova o plano focal um pouco mais fundo (ou seja, em direção ao lado ventral) e escolha o próximo plano focal onde as células não abladas aparecem.
- Execute a função de branqueamento conforme descrito acima (etapa 1.9). Repita essas etapas até que todas as células da estrutura neural de interesse tenham sido ablacionadas.
- Depois de passar por todos os planos focais que cobrem as estruturas neurais a serem abladas, verifique se as células estão com fluorescência abolida. Se algumas células ainda forem fluorescentes devido à ablação insuficiente, irradie-as novamente como descrito acima.
- Se a larva precisar ser recuperada da agarose após a irradiação do laser, não tente forçá-la a sair da agarose, pois isso pode danificar a larva. Em vez disso, faça cuidadosamente pequenos cortes na agarose ao redor da larva perpendicularmente à superfície de seu corpo. Em seguida, espere que a larva nade para fora da agarose por conta própria quando o anestésico passar.
- Prossiga para a próxima larva para ablação ou realize experimentos de controle usando outra população de neurônios que não estão envolvidos no comportamento sob investigação.
nota: Aqui, como controle, neurônios do bulbo olfatório em UAS: EGFP; As larvas de gSAIzGFFM119B foram ablacionadas a laser usando o mesmo protocolo descrito acima (Figura 2A, à direita).
- Aguarde várias horas ou 1 dia para a recuperação antes de prosseguir para a imagem Ca (Seção 2) ou registro comportamental (Seção 3). Durante esse tempo de recuperação, verifique a saúde das larvas (ou seja, natação espontânea normal, nenhum dano aparente pelo calor ao redor da área ablada, etc.) e remova as larvas que apresentem sinais de problemas de saúde.
2. Imagem de cálcio para registrar a atividade neuronal evocada por presas nas larvas de peixe-zebra ablacionadas por Pretectum
- Para preparar uma câmara de registro, coloque uma junta da câmara de hibridização de vedação segura em uma lâmina de vidro, com o lado adesivo voltado para o vidro, e remova a vedação superior.
nota: Isso cria uma pequena câmara de gravação com 9 mm de diâmetro e 0,8 mm de profundidade (Figura 3A).
- Em seguida, coloque uma tela de náilon (tamanho da abertura: 32 μm) em um tubo de 50 mL com o corte inferior aberto. Use a tampa para prender a malha no tubo (Figura 3B).
- Prepare o paramécio (que é a presa a ser usada como estímulo visual para a larva).
nota: Prepare a cultura de Paramecium (etapas 2.3.1 e 2.3.2) com antecedência.
- Obtenha a cultura de sementes de paramécia de fontes comerciais ou centros acadêmicos de bio-recursos com antecedência.
- Cultive o paramécio por vários dias em água contendo palha de arroz autoclavada e um pellet de fermento de cerveja seco (Figura 3C).
- Despeje a cultura de paramécio em 2 peneiras sucessivamente (uma com abertura de 150 μm, seguida por outra com abertura de 75 μm) para remover os detritos da cultura.
- Colete paramécia no fluxo da etapa anterior em uma malha de náilon (abertura de 13 μm).
- Ressuspenda o paramécio na malha de náilon em um béquer de vidro usando uma garrafa squeeze de água do sistema (Figura 3D).
- Enxágue a tela (Figura 3B) em água do sistema 2x (Figura 3E).
nota: O objetivo desta etapa é remover quaisquer possíveis odores e saborizantes contidos no meio de cultura de paramécio, pois o objetivo do presente estudo é observar a atividade neuronal visualmente conduzida.
- Coloque uma larva de peixe-zebra na solução de tricaína para anestesiar.
- Monte uma única larva em agarose de baixo ponto de fusão a 2%.
- Primeiro, coloque no micro-ondas 2% de acarose de baixo ponto de fusão e adicione 1/10 do volume de tricaína concentrada 10x à agarose.
- Coloque uma gota de agarose contendo tricaína na câmara de registro (Figura 3A).
- Depois de confirmar que a agarose não está muito quente, coloque a larva anestesiada (da etapa 2.5) na agarose, removendo imediatamente qualquer excesso de agarose para que a superfície da agarose pareça ligeiramente convexa.
- Oriente rapidamente a larva para a posição vertical com uma agulha de dissecação (Figura 1C).
nota: Esses procedimentos devem ser concluídos dentro de alguns segundos antes que a agarose se solidifique.
- Assim que a larva estiver posicionada corretamente, aguarde 5 minutos para que a agarose solidifique completamente. Em seguida, despeje uma gota de 1x solução de tricaína na agarose.
- Remova a agarose ao redor da cabeça da larva do peixe-zebra e abra espaço para o paramécio nadar usando uma faca cirúrgica. Para fazer isso, primeiro faça alguns pequenos cortes na agarose ( Figura 3F ). Em seguida, remova cuidadosamente o excesso de agarose despejando suavemente a água do sistema na câmara.
nota: Nesta etapa, a tricaína será lavada.
- Em seguida, coloque um paramécio na câmara de registro para servir como estímulo visual.
nota: Quando o paramécio nada perto da cabeça da larva do peixe-zebra, ele evoca uma resposta neuronal (Figura 3G).
- Coloque a câmara de gravação sob um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera CMOS científica (Figura 3H) e selecione uma lente objetiva de 2.5X (Figura 3I).
- Colete gravações de lapso de tempo dos sinais de fluorescência GCaMP.
- Inicie o aplicativo de aquisição de imagem para a câmera equipada.
- Clique em "Painel de sequência" e selecione "Registro de disco rígido" no painel. Na seção Configurações de Varredura, defina a "Contagem de Quadros" como 900 ou qualquer outro número total de quadros desejado.
nota: Se disponível, use um software de gravação de lapso de tempo com um módulo (aqui, "Registro de disco rígido") que permita salvar os dados com eficiência em um disco rígido.
- No painel "Capturar", defina o tempo de exposição em 30 ms (ou seja, 33,3 fps) e Binning 2 x 2.
- No painel de toque de controle do microscópio, escolha um conjunto de filtros para GFP, pois o GCaMP tem espectros de excitação/emissão semelhantes aos GFP.
- Clique em "Ao vivo" no painel Capturar para localizar a larva na câmera view e foco (Figura 4A) e, em seguida, clique em "Parar ao vivo" e clique no botão "Iniciar". Salve o filme em .cxd ou qualquer outro formato que contenha informações sobre a condição de aquisição.
