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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Eletrofisiologia
NOTA: O objetivo deste protocolo é obter registros de pinça de corrente de células inteiras de neurônios de células piramidais da camada II/III identificados visualmente pela expressão de GFP em cérebros de camundongos eletroporados por GFP (ou qualquer outra proteína fluorescente previamente eletroporada). Usando este protocolo, é possível estudar o efeito de uma modificação genética introduzida pela IUE nas propriedades elétricas do neurônio. A aquisição de modos de disparo específicos é um processo gradual de diferenciação que envolve a expressão dinâmica de um amplo repertório de canais iônicos e que resulta na expressão de modos de disparo transitórios antes dos estágios pós-natais tardios. Por exemplo, respostas elétricas maduras não são observadas nas camadas II / III do córtex somatossensorial de camundongos antes de P16.
- Pré-requisitos para os cortes agudos
- Prepare 1 L de ACSF usando alta pureza (água bidestilada Titular o pH para 7,3 - 7,4 com HCl ou NaOH. Ajuste a osmolaridade para 290 mOsm.
- Fazer bolhas ACSF com carbogênio (95% O2/5% CO2) por 15 a 20 min usando tubos de Teflon (~ 1 mm), para estabilizar o pH em 7,3 - 7,4.
- Pré-requisitos para o registro de células inteiras
- Certifique-se de que a estação de eletrofisiologia esteja equipada com uma câmara de registro, um sistema de perfusão, um microscópio, eletrodos (registro, estimulador e terra), macro e micromanipuladores, um tampo de mesa rígido resistente a vibrações e gaiola de Faraday, um estimulador, um amplificador e conversor analógico-digital (A/D), um computador com software de aquisição e um filtro GFP (ou qualquer outro fluorocromo) para análise de neurônios geneticamente modificados (Figura 1A).
- Prepare a solução intracelular, contendo 115 mM de gluconato de potássio, 2 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 20 mM de KCl, 4 mM de Na2ATP e 0,3 mM de Na3GTP, ajustado para pH 7,2 por KOH e para 290 mOsm por KCl.
- Faça pipetas de remendo puxando capilares de vidro borossilicato. Prepare eletrodos de adesivo usando um extrator de micropipeta. Use capilares de borossilicato (diâmetro externo de 1,5 mm, diâmetro interno de 0,86 mm, comprimento de 10 cm). Faça eletrodos de remendo mostrando resistências de 3-10 MΩ quando preenchidos com solução intracelular.
- Perfundir a câmara de registo com ACSF a um débito de 2 ml/min. Manter a temperatura da câmara a cerca de 33 °C.
- Gravação de células inteiras
- Transfira as fatias para a câmara de gravação usando uma pipeta Pasteur (corte a ponta longa) ou um pincel pequeno. Segure a fatia com uma harpa. Perfunda as fatias constantemente com ACSF a uma taxa de 2 mL / min.
- Patch um neurônio GFP-positivo.
- Coloque a fatia na câmara de registro e encontre a área de interesse através do microscópio com baixa ampliação (10X). Em seguida, encontre uma célula positiva para GFP para corrigir usando a objetiva de 60x.
- Encha o eletrodo de registro com solução intracelular. Use a seringa ligada ao filtro (filtro de 4 mm) e a ponta do microcarregador para encher o eletrodo de registro com solução intracelular.
- Coloque a pipeta de vidro no porta-pipetas. Coloque a ponta da pipeta no banho e concentre-se na ponta. Assim que a pipeta estiver no banho, aplique pressão positiva através do sistema de controle de contrapressão.
- Corrigir um neurônio fluorescente (Figura 1B).
- Aproxime-se da célula de interesse sob orientação visual, mantendo a contrapressão na pipeta. Após o aparecimento de uma pequena covinha na superfície da célula, libere a pressão. Neste ponto, uma vedação hermética (resistência maior que 1 GΩ) pode ser formada. Caso contrário, aplique uma leve pressão negativa (sucção) para facilitar.
- Enquanto a vedação está sendo formada, traga o clamp de tensão de retenção para -60 mV. Assim que o selo GΩ for formado, aplique um pulso de sucção para romper a membrana celular abaixo da pipeta e entre no modo de célula inteira.
- Registre a atividade usando as condições de pinça de corrente. Uma vez no modo de célula inteira, mude do voltage clamp para corrente clamp modo e comece a gravar. Por exemplo, para registrar a excitabilidade celular, aplique injeções de corrente despolarizante de 500 ms de comprimento (100 - 400 pA).
- Calcule as taxas de disparo plotando o número de potenciais de ação ao longo do trem para aumentar as correntes de entrada.
nota: O potencial de membrana em repouso, a resistência de entrada e a capacitância da membrana também podem ser calculados a partir das gravações.
