Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Leitões e manuseio de leitões
- Utilize leitões machos e fêmeas de maneira sistemática e aleatória para eliminar quaisquer potenciais fatores de confusão baseados no sexo, de acordo com as diretrizes ARRIVE.
NOTA: Como o período de crescimento cerebral máximo é de 3 a 5 dias após o nascimento dos leitões, a experimentação é feita apenas com leitões de 3 a 5 dias de idade.
- Certifique-se de que os leitões cheguem ao biotério pelo menos 24 horas antes da experimentação para permitir a aclimatação ao ambiente.
nota: Uma equipe veterinária treinada fornece cuidados de rotina com os animais. Os leitões são mantidos em gaiolas mantidas individualmente e monitoradas continuamente e recebem um substituto do leite nutricionalmente completo ad libitum para evitar hipoglicemia. Os leitões também são mantidos sem reposição de leite (nil per os), por pelo menos 3 h antes da anestesia e são fornecidos com cobertores e brinquedos para garantir níveis normais de estimulação. Se possível, mantenha vários leitões na mesma gaiola para permitir a socialização.
2. Desenvolvimento e personalização de matrizes de microeletrodos (MEAs) para estudos de neurotoxicidade induzida por anestesia (AIN) em um modelo de leitão
NOTA: Esta tecnologia usa MEAs baseados em enzimas que são pré-revestidos com enzima e galvanizados com dicloridrato de m-fenilenodiamina (mPD). Os eletrodos foram projetados sob medida com uma haste rígida de 40 mm e fabricados para uso em leitões (Figura 1).
- Consulte a descrição detalhada da preparação e calibração do MEA (Figura 2).
3. Anestesia e uso de aparelhos estereotáxicos personalizados para o leitão
- Anestesiar os animais usando uma estação de trabalho de anestesia com um ventilador apropriado e dispositivos de monitoramento e monitorar parâmetros fisiológicos como oximetria de pulso, pressão arterial não invasiva, eletrocardiografia e temperatura durante todo o experimento, conforme descrito anteriormente. Intubar e ventilar os leitões e administrar anestesia com sevoflurano a 1 concentração alveolar mínima (CAM) (aproximadamente 2,5-3%) por 3,5 h. Certifique-se de que membros treinados da equipe do laboratório estejam presentes para esses experimentos. O pêlo que recobre a área cirúrgica é removido com tesoura elétrica antes do preparo da pele.
nota: A concentração e a duração do anestésico utilizado permitem que o experimento simule o tempo de exposição real à anestesia durante um procedimento cirúrgico. Além disso, o sevoflurano é o anestésico geral mais comumente utilizado na população pediátrica, tornando a investigação em torno de sua segurança de extrema importância.
- Antes de colocar no quadro estereotáxico, inicie uma dose de ataque de rocurônio de 2,5 mg / kg e uma infusão de 1,5 mg / kg / h para evitar o movimento do animal enquanto estiver preso no quadro.
- Coloque o leitão na estrutura estereotáxica específica do leitão assim que uma profundidade adequada de anestesia for confirmada por pinça do dedo do pé.
- Forneça acolchoamento adequado dentro da estrutura estereotáxica, colocando o leitão em uma almofada de aquecimento de ar forçado com acolchoamento adicional (por exemplo, posicionador fluidizado) para evitar úlceras por pressão.
- Posicionar os dentes da mandíbula superior sobre a barra dentária (Figura 3).
nota: A barra do dente deve estar em um nível suficiente para manter o crânio firmemente no lugar.
- Fixe e aperte as barras auriculares penetrantes dentro das orelhas, tomando cuidado para garantir que o leitão esteja na posição da linha média. Posicione as pontas pontiagudas das alças laterais dentro do canal auditivo e insira as barras auriculares com firmeza suficiente para ouvir o som de "estalo" associado à penetração da membrana timpânica. Prenda firmemente as barras auriculares ao crânio e insira na mesma profundidade de cada lado para evitar o movimento do crânio durante o experimento (Figura 4, Painel A).
nota: É de vital importância manter o leitão aquecido (~ 37,8-38,6 °C) e monitorar continuamente a temperatura durante todo o procedimento para manutenção da normotermia. Isso pode ser feito por meio de um cobertor e/ou uma lâmpada de calor. Certifique-se de colocar a lâmpada de calor a uma distância adequada para evitar queimaduras na pele do animal.
- Faça uma incisão na linha média de 4-6 cm ao longo do crânio com cuidado para evitar marcar o crânio com o bisturi. Uma vez feita a incisão, use retração suave e dissecção romba para elevar o couro cabeludo do crânio. Esfregue suavemente o crânio com uma gaze para remover qualquer tecido conjuntivo e expor as linhas de sutura (Figura 4, Painel B).
nota: Não é necessário manter a esterilidade durante experimentos de não sobrevivência. No entanto, a esterilidade deve ser mantida durante os experimentos de sobrevivência.
- Refletir ainda mais o couro cabeludo, se necessário, para expor a área de interesse e determinar o local pretendido para a craniotomia (Figura 5, Painel A). Use uma broca cirúrgica para criar uma janela de craniotomia de aproximadamente 0,25 cm2 (pode ser maior ou menor, dependendo dos objetivos experimentais) sobreposta à estrutura de interesse, tomando cuidado para não ferir a dura-máter ou o cérebro subjacente (Figura 5, Painel B). Use uma tesoura cirúrgica fina para extirpar a dura-máter que cobre o tecido cerebral (Figura 5, Painel C).
- Posicione o eletrodo o mais verticalmente possível sobre o bregma, prendendo o braço de metal do headstage ao micromanipulador da estereotaxa do leitão. Abaixe o eletrodo o máximo possível sem tocar na superfície do crânio. Registre as coordenadas do bregma (Figura 6, Painel A).
- Determine as coordenadas ântero-posterior e médio-lateral, bem como a profundidade da estrutura de interesse no que se refere ao bregma. Determine as coordenadas estereotáxicas usando um atlas estereotáxico apropriado para a espécie e a idade. Neste caso, use um atlas estereotáxico desenvolvido especificamente para leitões.
- Reposicione o eletrodo de forma que tenha a localização ântero-posterior e médio-lateral adequada, garantindo que tanto o microeletrodo quanto o aparelho fiquem perpendiculares à superfície. Colocar o eletrodo de pseudo-referência sob o couro cabeludo, garantindo o contato com o animal (Figura 6, Painel B).
- Lenta e suavemente, abaixe o eletrodo até a profundidade apropriada no cérebro usando o braço estereotáxico. Para os 2 mm finais, use um microdrive hidráulico para conduzir o eletrodo até o local exato (Figura 6, Painel C).
nota: A posição do eletrodo deve revestir a janela de craniotomia. A profundidade do eletrodo varia de acordo com a estrutura cerebral de interesse. Não é necessário fechar a incisão após a conclusão da coleta de dados em experimentos de não sobrevivência.
4. Medição de Glutamato Extracelular Sob Anestesia com Sevoflurano
- Certifique-se de que o leitão esteja sob monitoramento fisiológico contínuo durante todo o procedimento. Os leitões são anestesiados por via inalatória (via cone facial) em preparação para o procedimento.
- Após o implante do MEA, aguarde 30 minutos para permitir que o eletrodo atinja a linha de base para garantir que a medição correta seja obtida por 3 h (Figura 7).
- A bupivacaína a 0,25% (1 mL/kg) é administrada por via subcutânea no local da cirurgia para controle da dor pós-operatória. Além disso, a buprenorfina de liberação sustentada é administrada por via subcutânea a cada 72 horas, conforme necessário.
