Registro da atividade neural do tecido hipocampal desdobrado usando matriz de microeletrodos penetrantes

Resumo

Fonte: Zhang, M., et al. Propagação da Atividade Neural em uma Preparação Desdobrada do Hipocampo com uma Matriz de Microeletrodos Penetrantes. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra o procedimento para configurar uma câmara de gravação com um conjunto de microeletrodos penetrantes (PMEA) para capturar sinais neurais de um hipocampo desdobrado. Este método nos permite estudar a velocidade e a direção da propagação da atividade neural dentro do hipocampo desdobrado in vitro.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada.

1. Soluções para Cirurgia e Gravação Experimental

1. Prepare um tampão normal de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) contendo (mM) NaCl (cloreto de sódio) 124, KCl (cloreto de potássio) 3,75, KH₂PO₄ (di-hidrogenofosfato de potássio) 1,25, MgSO₄ (sulfato de magnésio) 2, NaHCO₃ (bicarbonato de sódio) 26, Dextrose 10 e CaCl₂ (cloreto de cálcio) 2. Use este aCSF normal para a recuperação do tecido após a dissecção e para o sistema de lavagem no início do experimento.
2. Prepare a sacarose aCSF que é usada durante a dissecção do hipocampo e contém (mM): Sacarose 220, KCl 2,95, NaH₂PO₄ (dihidrogenofosfato de sódio) 1,3, MgSO₄ 2, NaHCO₃ 26, Dextrose 10 e CaCl₂ 2. Para induzir a atividade epileptiforme na preparação do tecido hipocampal intacto, adicione 4-aminopiridina (4-AP) ao aCSF normal na concentração de 100 μM.

2. Colocando o hipocampo desdobrado no conjunto de microeletrodos penetrantes (PMEA) para registrar a atividade neural

1. Para preparar a configuração experimental, encha um frasco com aCSF normal e outro frasco com 4-AP aCSF. Em ambas as garrafas, borbulhar 95% O₂/ 5% CO₂ desde o início de cada experimento. Use um conector de três válvulas para controlar qual solução será selecionada durante um experimento. Conecte um tubo de vácuo na saída da câmara para bombear a solução para um recipiente de pó. Aquecer a tubagem antes de a entregar na câmara de registo e manter a solução a um nível de temperatura controlado (35 °C).
2. Quando a entrada e a saída da câmara de gravação estiverem fechadas, use um conta-gotas de pipeta de vidro feito sob medida para transferir e colocar o hipocampo desdobrado na câmara. Sob o microscópio, posicione o hipocampo desdobrado usando um pincel pequeno comum enquanto o tecido está flutuando na solução. Coloque o hipocampo desdobrado com o lado alveus voltado para baixo, a área CA3 apontando para longe e o campo CA1 apontando para o pesquisador.
3. Sugue cuidadosamente a solução na câmara usando uma pipeta a vácuo da borda da câmara de registro para diminuir o nível da solução até que a câmara esteja seca e o tecido seja baixado para a matriz. Em seguida, coloque cuidadosamente uma âncora de tecido feita sob medida (Figura 1) (nº 7 em Materiais e Equipamentos Específicos) em cima do tecido para segurar o hipocampo desdobrado na matriz. Coloque algumas gotas de solução na câmara de registro para reabastecê-la e abra gradualmente a entrada e a saída para ajustar a taxa de fluxo para cerca de duas gotas por segundo na câmara de gotejamento IV.
4. Incube o tecido na câmara de registro com aCSF normal por cerca de 1 min para se recuperar, depois mude o suprimento de solução para aCSF dissolvido 4-AP e ajuste a taxa de fluxo corretamente. Incube o tecido em 4-AP dissolvido aCSF por cerca de 5 a 10 minutos e, em seguida, o pesquisador pode iniciar o software para registrar o sinal quando a atividade espontânea aparecer.

Resultados

Figura 1. Configuração experimental. (A) Uma tampa de plástico com parafusos é colocada sobre os circuitos para protegê-la contra possíveis danos causados pela água. A câmara de registro possui tubos de entrada e saída para transportar o fluxo da solução. Uma âncora de tecido feita sob medida colada com uma malha de fibra de nylon é usada para proteger o tecido durante os experimentos. (B) <...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pincel pequeno	Lowe's	tem #: 105657 Modelo #: 90219	Aquele com o menor tamanho em um pacote de pincel normal
Ferramenta de ajuda de vidro polido a fogo	N/A	N/A	Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares.
Agulha de vidro feito-à-medida	N/A	N/A	Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares.
Ferramenta de vidro feita sob medida com um laço de fio de metal	N/A	N/A	Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares com um laço de fio de metal remodelado.
Conta-gotas de solução de vidro feito sob medida	N/A	N/A	Esta ferramenta foi feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares com suas pontas cortadas e uma cabeça de borracha presa com a extremidade cortada.
Âncora de tecido personalizada	N/A	N/A	A malha de fibra de nylon foi colada em um anel de fio de cobre isolado. A âncora de tecido foi segurada por um micromanipulador.
Matriz de microeletrodos fabricada sob medida	N/A	N/A	Mais detalhes sobre a matriz, consulte Kibler, et al, 2011.
Circuitos de filtro e amplificadores personalizados para a matriz	N/A	N/A	Mais detalhes sobre a matriz, consulte Kibler, et al, 2011.
Processador de aquisição de dados 3400a	Laboratórios Microstar	N/A	Este é um sistema completo de aquisição de dados com conversor A/D.