Preparando um modelo de rato para avaliar a integridade da via visual usando uma configuração de eletrofisiologia

Abstract

Fonte: Nguyen, C. T. et al., Registro simultâneo de eletrorretinografia e potenciais evocados visuais em ratos anestesiados.J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a preparação de um modelo de rato para estudar a saúde da retina e a integridade das vias visuais. O potencial evocado visual e a referência de eletrorretinografia e os eletrodos ativos são conectados ao rato, seguidos pelo alinhamento da plataforma com o rato na frente da tigela de Ganzfeld para iluminação retiniana uniforme e fechamento da gaiola de Faraday para evitar interferência externa.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Pré-implante de eletrodos de potencial evocado visual crônico (VEP)

NOTA: Se os sinais simultâneos de eletrorretinograma (ERG) e VEP forem coletados, os animais devem ser implantados cirurgicamente com eletrodos de VEP pelo menos 1 semana antes da coleta do sinal.

1. Esterilize a bancada cirúrgica antes da experimentação limpando com clorexidina (0,5% em etanol a 70%). Autoclave todo o equipamento cirúrgico antes de usar. Cubra o animal com uma cortina cirúrgica esterilizada. Certifique-se de que todos os experimentadores usem máscaras cirúrgicas, aventais e luvas esterilizadas.
2. Induza a anestesia com 3 - 3,5% de isoflurano com O₂ a uma taxa de fluxo de 3 L/min. Mantenha a anestesia a 1,5% e 2 L/min durante toda a cirurgia. Garanta profundidade suficiente de anestesia pela ausência de reflexo de pinça da pata.
3. Aplique 1% de carboximetilcelulose sódica na córnea para evitar o ressecamento dos olhos.
4. Raspe uma área de 30 mm x 30 mm sobre a testa, posterior aos olhos e anterior às orelhas.
5. Coloque o animal em uma almofada térmica (37°C) para manter a temperatura corporal e estabilizar a cabeça do animal com uma estrutura estereotáxica.
6. Desinfete a área raspada com iodopovidona a 10% três vezes. Para a área próxima aos olhos, evite o uso de anti-sépticos à base de álcool, de acordo com o Padrão de Prática estabelecido pela Association of Surgical Technologists.
7. Faça uma incisão mediano-sagital na cabeça com um bisturi e, a partir deste excise, um círculo de ~ 20 mm de diâmetro de tecido dérmico para expor o osso craniano.
8. Remova o periósteo subjacente raspando e secando com gaze para expor as suturas cranianas coronal e sagital.
9. Usando uma broca dentária presa a uma broca, trepane dois orifícios (0,7 mm de diâmetro, profundidade ~ 1 mm) através do crânio em ambos os hemisférios nas coordenadas estereotáxicas: 7 mm caudal ao bregma, 3 mm lateral à linha média.
10. Aparafuse os parafusos de aço inoxidável (diâmetro 0,7 mm, comprimento 3 mm, esterilizados com clorexidina) nos dois orifícios pré-fabricados até uma profundidade de ~ 1 mm (2 mm de parafuso exposto) para permitir uma ancoragem firme. Isso entra em contato com a dura-máter sem danificar o tecido cortical subjacente.
11. Prepare a área cirúrgica para o amálgama dentário secando o osso craniano com gaze e retraindo a pele solta com duas suturas 3 - 0 em ~ 4 e 8 horas.
12. Espalhe o amálgama dentário sobre o crânio exposto para prender os eletrodos de parafuso (parafusos de aço inoxidável descritos na etapa 1.10) no lugar. Certifique-se de que ~ 1.5 mm dos parafusos permaneçam expostos para gravação.
13. Remova as suturas de retração.
14. Injete carprofeno a 0,5% por via subcutânea (5 mg/kg) para analgesia e solução salina (cloreto de sódio 0,9%, 1,5 ml) por via subcutânea para reposição de fluidos.
15. Permita que os animais se recuperem em gaiolas separadas. Não deixe um animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
16. Não devolva o animal à companhia de outros animais até que ele esteja totalmente recuperado da cirurgia (mínimo 5 dias).
17. Continue a administrar carprofeno a 0,5% por via subcutânea para analgesia (5 mg / kg) uma vez ao dia por 4 dias.
18. Registre ERG e VEP 1 semana após a cirurgia.

2. Gravação ERG e VEP

1. Preparação da coleta de dados
   1. Use um software de computador para acionar simultaneamente o estímulo e adquirir dados de acordo com as configurações recomendadas abaixo.
      1. Amplifice os sinais (ERG: ×1.000, VEP: x10.000) com o ganho definido internamente por um pré-amplificador e amplificador isolados, e com ambos os olhos combinados para impedância.
      2. Defina a taxa de amostragem para o ERG para 4 kHz em uma janela de gravação de 650 ms (2,560 pontos), Para fazer isso, clique na guia "base de tempo" no software de aquisição de dados (para nome e versão do software, consulte Tabela de Materiais), selecione "2,560" para Samples e "500 ms" para o tempo que retornará uma janela de gravação de 650 ms.
         1. Use o mesmo método para definir a taxa de amostragem para o VEP para 10 kHz em uma época de 250 mseg. Permita uma linha de base pré-estímulo de 10 ms para gravações de ERG e VEP. Para fazer isso, clique na guia "Configuração"; selecione "Estimulador" para abrir uma nova janela de diálogo; nessa janela, selecione "pulso" na lista suspensa para "Modo"; e defina o valor de "atraso" para "10 ms".
      3. Defina a filtragem passa-banda ERG para 0,3 - 1.000 Hz (- 3 dB). Isso é feito clicando em "Bio Amplifier" no software de aquisição de dados. Em seguida, defina o valor de "High Pass" para "0.3Hz" e o valor de "low pass" para "1 kHz".
      4. Usando o método acima mencionado em 2.1.1.3, defina as configurações de passagem de banda VEP para 0,1 - 100 Hz (- 3 dB) conforme recomendado pela Sociedade Internacional de Eletrofisiologia Clínica da Visão (ISCEV) para gravações VEP humanas.

2. Preparação do eletrodo

1. Personalize os eletrodos ERG ativo/inativo e VEP ativo/inativo conectando fio de prata ou um clipe jacaré a um eletrodo, respectivamente. Obtenha comercialmente eletrodo de aterramento.
2. Para os 4 eletrodos feitos sob medida, corte a extremidade macho da extensão do eletrodo. Remova 1 cm do revestimento externo de isolamento de politetrafluoretileno com uma lâmina de bisturi, garantindo que o fio interno não seja danificado.
3. Pré-forme os eletrodos inativos do ERG cortando um fio de prata de 70 mm de comprimento (0,3 mm de espessura) e formando um laço de ~ 8 mm de diâmetro para circundar o olho do rato. Prepare um círculo uniforme moldando o laço em uma ponta de pipeta de 1 ml.
4. Pré-moldar eletrodos inativos VEP cortando um comprimento de prata de 70 mm e formando uma elipse ~ 8 mm de diâmetro longitudinal para enganchar em incisivos de ratos.
5. Pré-molde os eletrodos ativos do ERG cortando um fio de prata de 30 mm de comprimento e formando um pequeno laço para entrar em contato suavemente com a córnea do rato (~ 1-2 mm de diâmetro)
6. Prenda com segurança os eletrodos (2 ERG ativos, 2 ERG inativos, 1 VEP inativos) ao eletrodo entrelaçando a prata com o fio interno exposto.
7. Isole o excesso de metal exposto com fita adesiva para reduzir artefatos fotovoltaicos.
8. Nos eletrodos inativos do ERG, cole um pequeno pedaço de fecho de velcro (~ 5 mm × 20 mm) na fita adesiva para permitir uma fixação estável à alça do pescoço do roedor.
9. Prenda o clipe jacaré ao fio interno dos fios do eletrodo para tornar os eletrodos ativos do VEP.
10. Antes das gravações, galvanize as superfícies expostas dos fios de prata (ou seja, o anel inativo e a ponta ativa) com cloreto usando uma fonte de 9 V DC por 20 segundos para melhorar a condução do sinal.
    1. Para fazer isso, mergulhe a ponta prateada do fio do eletrodo ERG (atuando como o ânodo de uma célula primária) em solução salina normal; e conecte a outra extremidade deste fio do eletrodo ao terminal positivo de uma bateria de 9 V.
    2. Conecte outro fio (o cátodo) ao terminal negativo da bateria e mergulhe a outra extremidade na solução salina também. Desconecte após 20 segundos e observe a ponta prateada do fio do eletrodo ERG ser revestida uniformemente na cor branca.
       NOTA: Prepare novos eletrodos ERG para cada sessão experimental (~ até 8 horas) para garantir a permeabilidade do revestimento de cloreto.

3. Preparação dos animais

1. Adapte os animais durante a noite (≥ 8 horas) antes das gravações em uma sala à prova de luz. Garanta a máxima adaptação ao escuro desligando as luzes da sala e fechando todas as portas e persianas. Minimize o vazamento de luz colocando materiais à prova de luz ao redor das junções de portas/janelas e colocando telas de computador fora de cortinas pretas grossas.
2. Conduza a preparação do animal em uma sala escura com o auxílio de diodo emissor de luz vermelho escuro (LED; 17,4 cd.m-2, λ_max = 600 nm) para manter a sensibilidade da haste.
3. Anestesiar o rato injetando cetamina/xilazina (60: 5 mg/kg) por via intramuscular. Confirme a profundidade suficiente da anestesia pela ausência de um reflexo de pinça da pata.
4. Para manter a sedação, administre uma dose adicional de anestesia (50% da dose inicial) após 50 minutos, se necessário.
5. Para anestesia tópica adicional, aplique uma gota de proxymetacaína a 0,5% em cada olho e pisque o excesso de líquido.
6. Para dilatação da pupila, aplique uma gota de tropicamida a 0,5% em cada olho e, em seguida, seque o excesso de líquido.

4. Posicionamento dos eletrodos ERG e VEP

1. Coloque o animal na plataforma ERG em frente à tigela Ganzfeld situada na gaiola de Faraday. Evite usar uma almofada de aquecimento elétrico, pois pode introduzir ruído elétrico nos registros eletrofisiológicos.
   NOTA: A plataforma é fixada a uma plataforma de água aquecida circulada para manter a temperatura corporal.
2. Prenda o animal à plataforma com uma tira de velcro colocada firmemente, mas não firmemente ao redor da nuca.
3. Prenda o eletrodo VEP inativo ao redor dos incisivos inferiores do rato anestesiado.
4. Posicione os eletrodos inativos do ERG circundando o anel escleral de forma não invasiva ao redor do equador do olho. Estabilize isso prendendo eletrodos à tira de velcro ao redor da nuca. Repita para o olho contralateral.
5. Prenda os eletrodos ativos do VEP prendendo pinças jacaré a parafusos de aço inoxidável pré-implantados no crânio.
6. Coloque uma pequena gota de carboximetilcelulose sódica a 1% na córnea antes da colocação do eletrodo ativo ERG para melhorar a qualidade do sinal.
   NOTA: O fluido de viscose também ajuda a manter a hidratação da córnea durante a experimentação para minimizar a formação de catarata do tipo dessecação em roedores.
7. Coloque uma pequena gota de carboximetilcelulose sódica a 1% nos incisivos inferiores para melhorar o contato do eletrodo inativo VEP e, assim, a qualidade do sinal.
8. Posicione os eletrodos ativos do ERG para tocar levemente a superfície central da córnea usando um micromanipulador conectado a um braço estereotáxico personalizado.
9. Insira 2 - 5 mm do eletrodo da agulha retificada (aço inoxidável) por via subcutânea na cauda.
10. Se necessário, seque qualquer excesso de líquido da pálpebra inferior antes de gravar para melhorar a qualidade do sinal.
11. Deslize a plataforma para mais perto da tigela de Ganzfeld, garantindo que os olhos do animal estejam alinhados com a abertura da tigela para permitir uma iluminação uniforme de ambas as retinas (consulte a etapa 2.4.1).
12. Feche a gaiola de Faraday para reduzir ruídos estranhos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clipe jacaré	Marca genérica	HM3022	Clipe de aço inoxidável de 26 mm para conectar eletrodos de parafuso VEP a cabos
Bioamplificador	ADInstruments	ML 135	Para amplificar sinais ERG e VEP
Carboximetilcelulose sódica 1,0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Fluido viscoso para melhorar a qualidade do sinal do eletrodo ERG ativo
Carprofeno 0,5%	Grupo de Saúde Animal Pfizer	CAS 53716-49-7	Nome proprietário: Rimadyl injetável (50 mg/mL). Para analgesia pós-cirúrgica, diluída a 0,5% (5 mg/mL) em soro fisiológico
Clorhexadina 0,5%	Laboratórios Orion	27411, 80085	Para desinfecção de instrumentos cirúrgicos
Banho-maria circulante	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Para manter a temperatura corporal do animal anestesiado durante a cirurgia e registros eletrofisiológicos
Amálgama dentário	DeguDent GmbH	64020024	Para envolver o conjunto eletrodo-crânio para torná-lo mais robusto
Broca dentária	Instrumentos Storz, Bausch e Lomb	#E0824A	Uma cabeça de broca em miniatura de ~ 0,7 mm de diâmetro para fazer um pequeno orifício no crânio sobre cada hemisfério para implantar parafusos VEP
broca	Bosch	Série Dremel 300	Uma broca automática para trepanação
Eletrodo	Telefator de grama	F-E2-30	Cabos de platina para conectar eletrodos de fio de prata ao amplificador
Gaiola de Faraday	sob medida		Garante à prova de luz para manter a adaptação ao escuro. Inclui a configuração Ganzfeld para melhorar a relação sinal-ruído
Cotonetes de gaze	Produtos Médicos Multigate Pty Ltd	57-100B	Para secar a incisão cirúrgica e a superfície exposta do crânio durante a cirurgia
Esfera integradora de Ganzfeld	Soluções Fotométricas Internacional		Estimulador de luz personalizado: 36 mm de diâmetro, tamanho de abertura de 13 cm
VELCRO	VELCRO Austrália Pty Ltd	Envoltório reutilizável da marca VELCRO	Fecho de velcro para prender os eletrodos e o animal na plataforma de gravação
Isoflurano 99,9%	Abbott Australásia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Nome proprietário: Anestésico por inalação Isoflo(TM). Anestésico inalatório de grau farmacêutico misturado com gás oxigênio para cirurgia de implante de eletrodo VEP
Cetamina	Laboratórios Troy	Ilium Ketamil	Nome proprietário: Ketamil Injection, Marca: Ilium. Anestésico de grau farmacêutico para registro eletrofisiológico
LEDs Luxeon	Phillips Iluminação Co.		Para estimulação de luz vinte LEDs de 5 watts e um de 1 watt.
Micromanipulador	Aparelho de Harvard	BS4 50-2625	Mantém o eletrodo ativo ERG durante as gravações
Eletrodo de agulha	Telefator de grama	F-E2-30	Inserido subcutaneamente na cauda para servir como eletrodo de aterramento para o ERG e o VEP
Fenilepfrina 2,5% mínimos	Bausch e Lomb	CAS 61-76-7	Instilado com Tropicamida para obter dilatação máxima para gravação de ERG
Iodopovidona 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nome proprietário: Betadine, Anti-séptico para preparar a pele raspada para cirurgia 10%, 500 mL
Sistema de aquisição de dados Powerlab	ADInstruments	ML 785	Controla os LEDs
Proxymetacaína 0,5%	Laboratórios Alcon	CAS 5875-06-9	Para anestesia da córnea durante gravações de ERG
Solução salina	Gelflex		Não injetável, para galvanoplastia de eletrodos de fio de prata
Software de escopo	ADInstruments	Versão 3.7.6	Aciona simultaneamente o estímulo através do sistema Powerlab e coleta dados
Prata (fio redondo fino)	A&E metal	0,3 milímetros	Usado para fazer eletrodos ERG ativos e inativos e o eletrodo VEP inativo
Parafusos de aço inoxidável	MicroFasterners		Eixo de 0,7 mm de diâmetro, 3 mm de comprimento para ser implantado sobre o córtex visual primário e servir como eletrodos VEP ativos
Quadro estereotáxico	David Kopf	Modelo 900	Um instrumento estereotáxico de pequenos animais para localizar os córtices visuais primários de acordo com as coordenadas do atlas do cérebro de ratos de Paxinos & Watson de 2007
Lâmina cirúrgica	Swann-Morton Ltda.	206	Para incisão na área da pele que cobre o córtex visual primário para implantar os eletrodos VEP
sutura	Xangai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd		Sutura trançada de seda 3-0 não absorvível, para retração da pele durante a cirurgia de implante de eletrodo VEP
Pomada para os olhos de tobramicina 0,3%	Laboratórios Alcon	CAS 32986-56-4	Nome próprio: Tobrex. Pomada antibiótica profilática aplicada ao redor da ferida cutânea após a cirurgia
Tropicamida 0,5%	Laboratórios Alcon	CAS 1508-75-4	Nome proprietário: 0,5% de colírio de midriacil, instilado para obter midríase para gravação de ERG
xilazina	Laboratórios Troy	Ílio xilazil-100	Anestésico de grau farmacêutico para registro eletrofisiológico
Ponta de pipeta	Eppendorf Pty Ltd	Nº 0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL, para eletrodos feitos sob medida
Injeção de eutanásia de lethabarbo	Virbac (Austrália) Pty Ltd	LETHA450	325 mg/mL de pentobarbital sódico para eutanásia rápida
Microsoft Office Excel	Microsoft	Versão 2010	Software de planilha para análise de dados