A contração da artéria mesentérica e Estudos Relaxamento Usando Miografia Fio Automated

Resumo

Um método automatizado para medições Miografia vigor em artérias mesentéricas isoladas é descrito. Ele emprega um Mulvany-Halpern Auto Myograph fio duplo 510A para determinar as respostas à fenilefrina e cálcio extracelular. O método permite a determinação consistente de respostas isométrica aos agonistas em pequenos vasos de diâmetros de 60 - 300 mm, de forma independente.

Resumo

Vasos de resistência proximal, tais como as artérias mesentéricas, contribuem substancialmente para a resistência periférica. Esses pequenos vasos entre 100-400 mM em função de diâmetro principalmente no direcionamento do fluxo de sangue para vários órgãos de acordo com os requisitos gerais do corpo. A artéria mesentérica de ratos tem um diâmetro superior a 100 mm. A técnica Miografia, primeiramente descrita por Mulvay e Halpern ^1, foi baseada no método proposto por Bevan e Osher ^2. A técnica fornece informações sobre navios de pequeno porte em condições isométricas, onde o encurtamento substancial da preparação muscular é impedida. Desde produção de força e sensibilidade de navios para diferentes agonistas é dependente da extensão do trecho, de acordo com a relação tensão-comprimento ativo, é essencial a realização de estudos de contração isométrica em condições para impedir o cumprimento dos fios de montagem. Fios de aço inoxidável são preferíveis aos fios de tungstênio por causa da oxidação deste último, que afeta as respostas registradas ^3. A técnica permite a comparação de agonista-induzida contrações dos vasos montados para obter provas para a função normal de receptores vascular das células musculares lisas.

Temos demonstrado em vários estudos que artérias mesentéricas isoladas que são contratados com phenylyephrine relaxar com a adição de concentrações cumulativas de cálcio extracelular (Ca ^{2 +} _e). As descobertas levaram-nos a concluir que os nervos sensoriais perivascular, que expressam a proteína G acoplada Ca ^{2 +} receptor-sensing (CaR), mediar esta resposta vasorelaxamento. Utilizando um método automatizado Miografia fio, mostramos aqui que artérias mesentéricas de Wistar, Dahl sensíveis ao sal (DS) e Dahl sal-resistentes (DR) ratos respondem diferentemente ao Ca ^{2 +} _e. Tecidos de ratos Wistar mostrou Ca ^{2 +} maior sensibilidade em comparação com os de DR e DS. CaR expressão reduzida em artérias mesentéricas de ratos DS correlaciona-se com Ca ^{2 +} reduzida de relaxamento _e-induzida de isoladas, pré-contraídos artérias. Os dados sugerem que o carro é necessário para o relaxamento das artérias mesentérica sob tônus ​​adrenérgico aumentado, como ocorre na hipertensão, e indicar um defeito inerente na via de sinalização CaR em animais Dahl, que é muito mais grave no DS.

O método é útil para determinar a reatividade vascular ex vivo nas artérias mesentéricas de resistência e similares pequenos vasos sanguíneos e comparações entre diferentes agonistas e / ou antagonistas podem ser facilmente e constantemente avaliada lado a lado ^6,7,8.

Protocolo

1. Isolamento da artéria mesentérica de ratos pequenos

1. Anestesiar animais com isoflurano em uma câmara fechada e limpe o abdômen com álcool.
2. Realizar uma laparotomia na linha média para expor cama mesentérica.
3. Com uma tesoura, retire cerca de 85 cm de intestino com a alimentação vasculatura com a artéria mesentérica superior. Corte a extremidade proximal da seção intestinal perto do piloro e da extremidade distal perto da junção íleo-coecal. Segmentos do intestino são isolados de ratos que estão profundamente anestesiados com isoflurano e submetidos à eutanásia por open-peito punção cardíaca.
4. Colocado seção extirpado numa placa de Petri revestidas contendo PSS e realizar a dissecção da artéria mesentérica em temperatura ambiente.
5. Pino para baixo a extremidade proximal do intestino no lado direito e pinos para fora o restante da direção intestineina sentido anti-horário (final ieproximal sobre a vasculatura alimentação deixou do outro lado do intestino).
6. Dissecar o ramo II e III segmentos juntos com um pedaço do segmento proximal.
7. Dissecar a veia e isolar a artéria (com V-shaped ponto de ramificação) e limpá-la através da remoção do tecido adiposo e conjuntivo. Evitar o contato direto com a artéria puxando delicadamente com uma pinça e corte através da membrana do tecido conjuntivo.

2. Montagem do navio

1. Corte dois pequenos segmentos (≈ 4 cm) de um 40 mM de tungstênio sem fio de aço inoxidável e, com uma pinça fina, insira um para o lúmen de cada artéria tomando cuidado para não danificar o endotélio. Use a ponta do fio para abrir a luz, se necessário. Sangue escorrendo para fora da embarcação é um bom sinal o lúmen é aberto.
2. Encha a câmara myograph com solução salina fisiológica (PSS; mM: 115 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 5 NaHCO _3, 1,2 K ₂ HPO _4, 1,1 Na ₂ HPO _4, 1,0 CaCl _2, 20 e HEPES 5 de glicose, pH 7,4) com ácido ascórbico (100 mM) a 37 ° C e usando fórceps transferir cuidadosamente o segmento de rosca navio da placa de Petri na câmara à temperatura ambiente e transferir o segmento navio excisadas proximal para a câmara de myograph e puxe a final ao longo do fio para alimentá-lo dentro do vaso. Evitar esticar o navio.
3. Garantir o fim próximo do fio de sentido anti-horário sob o parafuso de fixação perto na mandíbula do lado direito ligado ao micrômetro. Pegar a extremidade livre do fio com uma pinça e prenda-o no sentido horário sob o parafuso de fixação muito na mandíbula do lado direito. Certifique-se que o segmento de navios ao longo do fio está situado no intervalo entre as mandíbulas sem fazer qualquer contato com a própria mandíbula.
4. Parafuso as mandíbulas separadas, e alinhar o segundo fio paralelo com o navio e inseri-lo na extremidade da luz. Suavemente alimentar o fio através do lúmen do segmento de navio em um movimento usando o fio já está montado como um guia. Segure o fio cerca de 1 cm do navio para evitar esticar-la durante a manobra e evite tocar o endotélio.
5. Parafuso as mandíbulas juntas e garantir que o segundo move fio debaixo de montagem o primeiro garantido na mandíbula do lado direito.
6. Garantir o fim próximo do segundo fio no sentido horário sob o parafuso de fixação perto da mandíbula do lado esquerdo ligado ao transdutor.
7. Assegurar a extremidade do fio sob o parafuso de fixação na mandíbula do lado esquerdo e aperte para esticar o fio.
8. Uma vez que a montagem está completa, reinicie o motor no "Menu de montagem" e começar a normalização do navio.

3. Normalização

O Auto Myograph fio duplo System-510A tem uma função de normalização automatizado, que é avaliada a partir da "normalização" no menu e permite que o navio a ser esticado a uma circunferência normalizado interna por um procedimento padronizado de acordo com o protocolo do fabricante, após equilíbrio por 30 min a 37 ° C. Uma curva exponencial é então ajustada aos dados de pressão interna circunferência. O procedimento define o diâmetro do lúmen (d 100) que a artéria teria in vivo quando relaxado e sob uma pressão transmural de 100 mmHg ¹ Os parâmetros de normalização para artéria mesentérica de ratos são as seguintes.:

1. Pressão transmural alvo = 13,3 kPa (100 mm Hg).
2. Tempo = 60 seg; Duração de cada uma das etapas de normalização.
3. IC ₁ / IC ₁₀₀ = 0,9 (IC ₁ = circunferência normalizado interna, IC ₁₀₀ = circunferência interna correspondente à pressão alvo.
4. Calibração ocular 2 * Δ (mm / ocular divisão); 2 delta é por razões de programação.

Meça o comprimento da artéria mesentérica montado usando o microscópio de olho peça leituras quando os fios são mais as extremidades longe e de perto do navio montado segment. Resumidamente, o comprimento do segmento de navio montada é medida a ampliação máxima com uma ocular calibrada olho peças no microscópio de dissecação. A leitura do olho peças com cabelo-line sobre a extremidade do segmento (a ₁₎ e perto do final do segmento (a ₂₎ nas divisões ocular são medidos e registados. Estes valores, com as leituras micrômetro, antes e após o alongamento da embarcação são registrados e entrou em menus para o programa para calcular a curva ajustada eo diâmetro interno correspondente à uma meta de pressão transmural de 100 mm Hg

Em nossos estudos, as artérias foram criados para o diâmetro do lúmen do d ₁ = 0,9 xd _100, onde o desenvolvimento força ativa é máxima. Desenvolvimento da força ativa de ≥ 10 mN em artérias mesentéricas de ratos é considerada ideal para experimentos para prosseguir. Tecidos com menor força ativa foram descartados.

4. Medição de respostas

Após a normalização, as propriedades mecânicas e funcionais dos vasos são re-ativado por realizar uma "start-padrão", que envolve vasos desafiador, com aplicações repetidas (normalmente 2 ou 3) de 5 mM de fenilefrina (PE) para obter contrações reprodutível. A "start padrão" típico em nosso laboratório consiste de uma série de estímulos e os períodos de washout da seguinte forma:

1. Substituir câmara myograph cobrir e começar a aeração com ar de 95% e 5% CO _2.
2. Encher a câmara com PSS fresco (ácido ascórbico, contendo 100 mM)
3. Navio contrato com 5 mM PE por 5 min e lavar 4 vezes com tampão de PSS.
4. Após a última lavagem, recarga com câmara de PSS e esperar 3 min antes de repetir os passos (ii) e (iii).

Após o início padrão, a artéria está pronto para o experimento. Relaxamento dos vasos contratados são avaliados pela adição cumulativa de concentrações crescentes de CaCl ₂ (0,5-4 mM). Embarcações, quando os inibidores são usados ​​são pré-incubadas com os compostos na câmara myograph por 20 min e presente durante os ensaios.

5. Análise de Dados

A "normalização" dos dados para os navios e os traçados força, diretamente convertido em dados de texto, foram analisadas com o programa de 11,0 SigmaPlot gráficos (Systat Software, Point Richmond, CA) e plotados como mostrado na Figura 1. Concentração-resposta de dados, calculados a partir dos traçados, foram analisados ​​através da determinação EC ₅₀ valores a partir de dados experimentais instalados em uma função logística quatro parâmetros no menu de Farmacologia do programa. Comparações entre grupos e dentro dos grupos foram realizadas por uma análise de variância (ANOVA) e as diferenças com 0,05 p

6. Resultados representativos:

Parâmetros	Wistar	Dahl sensíveis ao sal	Dahl sal-resistente
L 100 (mm)	83,26 ± 2,33	91,52 ± 4,67	117,45 ± 8,43 *
X 1	604,21 ± 41,97	752,24 ± 85,25	745,84 ± 110,09
r 2	0,99 ± 0,003	0,97 ± 0,008	0,97 ± 0,007

* A diferença entre os valores para L ₁₀₀ Wistar e DR são estatisticamente significativas. Shapiro-Wilk teste de normalidade passado (p = 0,588), Teste de Igualdade de Variância passado (p = 0,237).

L ₁₀₀ = diâmetro interno do segmento montado correspondente à pressão transmural alvo.

X ₁ = A configuração do posicionador micro necessário para esticar o navio montado em sua circunferência interna normalizado (ou seja, o valor da leitura micrômetro em que os experimentos foram realizados).

r ² = coeficiente de regressão para ajuste de (X _i, Y _i) para uma curva exponencial.

NB: O procedimento detalhado está descrito no manual para o Sistema Myograph 510A ^6.

Tabela 1. Sample Leia-Out dos parâmetros de normalização para os segmentos de artéria mesentérica Wistar, DS e DR de programa básico mostrado no "Menu normalização". Os valores são médias (± SEM) de 5 animais. * As diferenças entre os valores para L ₁₀₀ Wistar e DS são estatisticamente significativas (p <0,05).

Wistar	DS	DR
14,2 ± 0,6		20,9 ± 1,3 *

Tabela 2. Tensões Desenvolvidos (mN) em artérias mesentéricas isoladas de Wistar, DS e ratos DR, na sequência de pedidos de 5 mM PE para cada navio. Valores reportados são meios (± SEM) de 6-8 animais. * Significativamente diferente do Wistar controles (p <0,05).

Figura 1. Ca ^{2 +} _e relaxamento induzido de uma artéria mesentérica PE-contratados a partir de um rato Wistar montado em um myograph fio em solução salina fisiológica contendo 1 mM Ca ^{2 +.} A artéria foi equilibrada por 30 min a 37 ° C com aeração constante e respostas para Ca ^{2 +} _e determinado. Uma força representativa de rastreamento em adição de 5 mM PE seguido por adições acumulada de Ca ^{2 +} é mostrada.

Figura 2. Ca ^{2 +} _e relaxamento induzido de uma artéria mesentérica PE-contratados a partir de um rato DS montado em um myograph fio em solução salina fisiológica contendo 1 mM Ca ^{2 +.} A artéria foi equilibrada por 30 min a 37 ° C com aeração constante e respostas para Ca ^{2 +} _e determinado. Uma força representativa de rastreamento em adição de 5 mM PE seguido por adições acumulada de Ca ^{2 +} é mostrada. Ca ^{2 +} relaxamento foi severamente comprometida neste tecido em comparação com aqueles de ratos Wistar e DR.

Figura 3. Ca ^{2 +} _e relaxamento _induzido de uma artéria mesentérica PE-contratados a partir de um rato DR montado em um myograph fio em solução salina fisiológica contendo 1 mM Ca ^{2 +.} A artéria foi equilibrada por 30 min a 37 ° C com aeração constante e respostas para Ca ^{2 +} _e determined.A força representativa de rastreamento em adição de 5 mM PE seguido por adições acumulada de Ca ^{2 +} é mostrada.

Figura 4. A. [Ca ^{2 +]} _e-resposta curvas. B. O gráfico de barras mostrando EC ₅₀ valores para o relaxamento determinado pelo ajuste dos dados para um quatro expressão curve.C.CaR parâmetro logística em arcadas mesentéricas isoladas de ratos DR e DS.

Discussão

A hipertensão é uma das principais causas de morbidade cardiovascular, renal e cerebral / mortalidade. A ocorrência de hipertensão é alta na população e hipertensão sal-sensível é particularmente elevada na população idosa, e mais prevalente em negros do que brancos. Este é acreditado para ser devido à tendência dos negros para reter sódio em seus rins ^9. Sal-sensibilidade é um fator importante que contribui para a doença renal e está associada à disfunção endotelial, mas o mecanismo não é totalmente compreen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome de equipamentos / reagentes	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Auto Myograph fio duplo System-510A DMT-EUA, Inc.	Atlanta, GA.	100151
PowerLab/4SP Sistema de Aquisição de Dados	ADInstruments, Colorado Springs, CO	ML750	Novos modelos com 4-16 canais de entrada estão disponíveis.
Dell Dimension XPS Gen 4 Computador	Dell
Stemi SV II (Apo) microscópio de dissecção com Ocular	Carl Zeiss International.
Wistar, Dahl sensíveis ao sal, Dahl sal-resistentes ratos	Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN.
Para roedores	Harland Tekland, Madison, WI.
Fenilefrina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
Outros produtos químicos			Todos os produtos químicos utilizados foram da mais pura notas disponíveis comercialmente.