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1. Configurando o aparelho de pipeta de sopro
NOTA: Existem cinco componentes básicos para esta configuração: a pipeta de vidro, o tubo, a seringa, o micromanipulador e o tampão (Hank's) Tabela 1. Qualquer tampão que tenha concentrações de sal fisiologicamente relevantes pode ser usado nesta configuração.
- Puxe uma pipeta de borossilicato para ter uma ponta de abertura de cerca de 45 μm de diâmetro usando um extrator de micropipeta e as especificações na Tabela 2.
NOTA: Verificou-se que 45 μm é um tamanho adequado para o diâmetro da abertura da pipeta em condições experimentais. Pequenas variações no tamanho da abertura não devem afetar significativamente os resultados. É importante observar que desvios maiores desse número ainda devem funcionar para a indução de varicosidade, ajustando a altura da seringa que está ligada à pipeta por meio de tubulação, mas isso exigirá a recalibração do valor da pressão.
- Insira a extremidade não puxada da pipeta em um tubo de borracha fino.
nota: A parede da tubulação deve ser fina e rígida para minimizar a resistência do fluido, garantindo que a altura da seringa seja diretamente proporcional à pressão do fluido que flui através da pipeta com resistência insignificante. A tubulação não deve ter mais de 0.6 m de comprimento para minimizar ainda mais a resistência.
- Conecte a outra extremidade do tubo a uma seringa de plástico de 10 mL por meio de um conector com uma válvula giratória.
nota: A seringa de plástico precisa ser mantida a uma altura constante e mensurável para garantir uma medida precisa da pressão presumida que flui da pipeta. Uma altura de 190 mm foi utilizada, pois fornece pressão mínima, mas induz varicosidades nos axônios de forma confiável. Outros valores de altura também podem ser usados se a pressão fizer com que as células se desprendam da superfície da lamínula. Recomenda-se que a mesma configuração seja usada durante todo o experimento.
- Insira a pipeta na tampa rosqueada do micromanipulador para mantê-la no lugar. Aparafuse o parafuso de metal de topo plano preso ao braço do micromanipulador de modo que ele segure a extremidade não puxada da pipeta logo acima de onde o tubo de borracha está conectado. Incline a pipeta em um ângulo de 45° com a superfície das lamínulas contendo neurônios. NOTA: O micromanipulador deve ser construído de forma que a pipeta possa ser segurada sem apertar o tubo de borracha. O micromanipulador deve permitir o movimento da pipeta nas direções x, y e z para posicioná-la com precisão dentro do alcance das células. Um gráfico e uma fotografia do aparelho são fornecidos abaixo (Figura 1).
- Ligue um filtro de fluorescência, abra a abertura e certifique-se de que um ponto fluorescente possa ser visto passando pela objetiva. Usando o micromanipulador, mova a pipeta para uma posição que alinhe a ponta com o ponto fluorescente e abaixe a pipeta para uma posição logo acima da altura da placa de cultura de células (35 mm x 10 mm). Quando estiver na posição, acenda a luz transmitida e desligue a fluorescência.
- Usando uma pinça, adicione uma lamínula (com as células voltadas para cima em direção à pipeta) da placa de cultura de células à placa de cultura de células contendo cerca de 2 mL de tampão de Hank à temperatura ambiente.
- Coloque a placa de cultura contendo a lamínula no escopo.
- Usando o botão de foco fino e a objetiva de 20X, concentre-se em um plano cerca de quatro voltas completas acima das células (cerca de 0,4 mm). Use o micromanipulador para posicionar a ponta da pipeta de forma que ela fique focada e no centro, lado esquerdo do plano, conforme visto através das oculares.
nota: Os dendritos são projeções que devem estar no mesmo quadro do corpo celular de onde se originam. Para induzir varicosidades axonais, deve-se seguir projeções mais longas do corpo celular para os axônios medial e distal.
2. Calibrando a pressão da pipeta utilizando um sistema de membrana elástica
- Configure o aparelho de pipeta de sopro com exatamente os mesmos parâmetros descritos acima em um sistema contendo uma membrana de silicone microfabricada (500 μm de diâmetro e 50 μm de espessura) e focalize o microscópio na superfície da membrana.
nota: Este sistema foi projetado para medir pequenos valores de pressão, e uma explicação do sistema foi publicada antes. Essa medição só precisa ser feita uma vez para experimentos de sopro se exatamente a mesma configuração de sopro for usada.
- Concentre o microscópio nas matrizes de micropontos (4 μm de diâmetro e 10 μm de distância, conforme medido entre os centros). Gire a válvula de bloqueio e deixe o fluido fluir para fora da pipeta. Examine a deflexão da membrana em resposta à pressão do fluido com um microscópio confocal.
- Utilize um modelo linear para determinar a pressão correspondente associada à deflexão da membrana.
nota: Embora um estudo recente tenha descoberto que uma deflexão de w = -3,143 ± 0,69 μm foi obtida para a altura da seringa de 190 mm, isso produziu uma pressão de 0,25 ± 0,06 nN / μm2 da configuração atual da pipeta, que está dentro da faixa fisiológica e patológica, embora a altura da seringa não seja o único determinante. Outros fatores também influenciam o valor exato da pressão nos neurônios, incluindo a abertura da pipeta, o posicionamento (distância e ângulo) da ponta da pipeta em relação às células e até mesmo a flexibilidade do tubo.
3. Puffing para induzir varicosidades
- Quando a pipeta estiver em posição, focalize o microscópio em um plano que contenha uma região de interesse. Posicione as células e os processos na metade esquerda do campo de imagem (visto pela captura ao vivo da câmera) dentro da área de sopro, enquanto a metade direita está fora da área de sopro.
nota: Devido ao extenso crescimento de axônios e dendritos de neurônios, é improvável que todos os processos de um neurônio estejam dentro da mesma área de sopro. Na verdade, essa é uma vantagem desse sistema, que permite o exame do efeito local do sopro. Existem dois tipos de sopro que podem ser utilizados para induzir varicosidades: sopro de longa duração e sopro de pulso.
- Soprar
- Puffing de longa duração
- Posicione a seringa a uma altura 190 mm acima da lamínula contendo os neurónios cultivados. Comece a imagem de lapso de tempo da área de interesse com um tempo de exposição otimizado, revelando uma morfologia neuronal clara. Capture pelo menos 15 quadros em um intervalo de 2 s (30 s no total) como linha de base. O intervalo pode ser ajustado com base no experimento. No quadro 16, abra a válvula de bloqueio giratória da seringa e deixe o fluido fluir por 75 quadros (150 s). No quadro 75, desligue a válvula para que o fluxo de fluido pare. Parar captura de vídeo.
NOTA: Isso deve induzir varicosidades axonais nos neurônios 7-9 DIV dentro de 5-10 s, enquanto os neurônios mais velhos demoram mais para formar varicosidades.
- Pulso (duração de 2 s)
- Posicione a seringa na altura adequada (190 mm). Comece a imagem com lapso de tempo e capture pelo menos 15 quadros (30 s) em um intervalo de 2 s. No quadro 16, abra a válvula da seringa e deixe o fluido fluir, depois feche a válvula após 2 s. Aguarde 5-20 s (dependendo da frequência a ser testada) antes de abrir a válvula novamente. Repita a abertura e o fechamento da válvula para criar pulsos de fluido e continue por um período total de 150-300 s. Continue a imagem de lapso de tempo por 20 min para capturar o estágio de recuperação.
nota: Quando o intervalo é maior que 10 s, os pulsos induzem drasticamente menos varicosidades. Em um intervalo de 20 s, nenhuma varicosidade pode ser induzida pelos pulsos. Para obter uma formação de varicosidade confiável e consistente, recomenda-se que a altura da seringa seja de cerca de 190 mm. A altura da seringa e a pressão do fluido não devem ser elevadas a um ponto em que as células comecem a se desprender da superfície da lamínula.
- Antes de um dia de uso, limpe a configuração (pipeta, tubo e seringa) fluindo cerca de 10 mL de etanol a 70% através da configuração. Após a lavagem com etanol, flua 10 mL do tampão de Hank (ou tampão desejado) através da configuração para preparar o sistema para o uso daquele dia. Depois de terminar os experimentos do dia, limpe a configuração conforme descrito anteriormente com etanol para evitar o crescimento de contaminantes durante a noite.
Tabela 1: Receita de buffer de Hank. Esta receita prepara o tampão utilizado no protocolo de sopro e durante a imagem de células vivas.
| Tampão de Hank (filtro, pH = 7,4, armazenar a 4 °C |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | Kcl |
| 1,2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/ml | D-glicose |
| 20 mM | HEPES |
Tabela 2: Parâmetros de tração da pipeta. Fornece os parâmetros a serem definidos no extrator de pipetas para obter uma abertura com cerca de 45 μm de diâmetro.
| Parâmetros de extração da pipeta |
| calor | puxar | velocidade | atraso | pressão | rampa |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
