Eletrônica de malha injetável para gravações estáveis de neurônio único no cérebro de um camundongo

Abstract

Fonte: Schuhmann Jr., T. G., et al. Eletrônica de malha injetável com seringa para eletrofisiologia crônica estável de roedores. J. Vis. Exp. (2018).

O vídeo demonstra a injeção de sondas eletrônicas de malha no cérebro de um camundongo para gravações estáveis de longo prazo em um nível de neurônio único. Um camundongo anestesiado com o crânio exposto é preso em uma estrutura estereotáxica e a região do dispositivo de malha da sonda é injetada no cérebro por meio de orifícios perfurados. Os blocos de entrada e saída da sonda são conectados a um circuito e as gravações são obtidas usando um sistema de aquisição de dados.

Protocol

1. Injeção estereotáxica de eletrônica de malha no cérebro de camundongo vivo

NOTA: Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal com uma mistura de 75 mg/kg de cetamina e 1 mg/kg de dexdomitor. O grau de anestesia foi verificado com o método de pinça do dedo do pé antes do início da cirurgia. A temperatura corporal foi mantida colocando o camundongo em um cobertor homeotérmico a 37 °C sob anestesia. A técnica estéril adequada foi implementada para a cirurgia, incluindo, mas não se limitando a, autoclavagem de todos os instrumentos cirúrgicos de metal por 1 h antes do uso, usando luvas esterilizadas, usando um esterilizador de esferas quentes durante toda a cirurgia, a manutenção de um campo estéril ao redor do local da cirurgia, a desinfecção de instrumentos plásticos com etanol a 70% e a pele do couro cabeludo depilado foi preparada com iodóforo antes da incisão. Para cirurgias de sobrevivência, após a conclusão da cirurgia, pomada antibiótica foi aplicada ao redor da ferida e o camundongo foi devolvido a uma gaiola equipada com uma almofada de aquecimento a 37 °C. Os camundongos não foram deixados sozinhos até que recuperassem a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Os camundongos receberam analgesia com buprenorfina por injeção intraperitoneal na dose de 0,05 mg / kg de peso corporal a cada 12 h por até 72 h após a cirurgia. Os camundongos foram isolados de outros animais após a cirurgia. Os camundongos foram eutanasiados por meio de injeção intraperitoneal de pentobarbital na dose de 270 mg / kg de peso corporal ou por perfusão transcárdica.

1. Anestesie o mouse e fixe-o em um quadro estereotáxico.
2. Aplique lubrificante ocular nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento durante a anestesia.
3. Use uma broca dentária e uma estrutura estereotáxica para abrir uma craniotomia nas coordenadas desejadas no crânio. Abra uma segunda craniotomia longe do local da injeção para a inserção de um parafuso ou fio de aterramento de aço inoxidável.
4. Fixe um substrato de fixação ao crânio com cimento dentário. Corte uma lacuna de aproximadamente 1 mm de largura no substrato para melhorar a confiabilidade da etapa de dobra posteriormente no procedimento.
   nota: Um cabo flexível plano (FFC) cortado em forma de "L" funciona bem (Figura 4A), embora muitos materiais funcionem desde que tenham a espessura correta para o conector de força de inserção zero (ZIF) de 32 canais (projetado para cabos de 0,18 ± 0,05 mm de espessura).
5. Monte o porta-pipetas com a agulha contendo os componentes eletrônicos da malha na estrutura estereotáxica usando uma extremidade em ângulo reto clamp (Figura 2C e Figura 3A).
6. Conecte a saída lateral do porta-pipeta a uma seringa de 5 mL presa em uma bomba de seringa (Figura 3D) usando um tubo capilar de aproximadamente 0.5–1 m de comprimento.
   nota: Certifique-se de que não haja bolhas no tubo capilar antes de conectá-lo ao porta-pipeta. As bolhas podem interromper o fluxo durante a injeção e impedir uma entrega suave e controlada dos componentes eletrônicos da malha.
7. Use a estrutura estereotáxica para posicionar a ponta da agulha no local inicial desejado dentro do cérebro.
   nota: As sondas eletrônicas de malha usadas aqui são projetadas com eletrodos de registro espalhados por um comprimento de cerca de 2 mm e com o primeiro eletrodo localizado a cerca de 0,5 mm da borda inicial da malha eletrônica (borda mais à esquerda na Figura 1A). Por esse motivo, as coordenadas estereotáxicas devem ser selecionadas de forma que o local inicial seja 0,5 mm mais profundo que a região do cérebro de interesse. A propagação e a localização dos eletrodos de gravação dentro da eletrônica da malha podem ser selecionadas livremente durante o processo de design da máscara e devem ser selecionadas de forma que os eletrodos de gravação abranjam a(s) região(ões) cerebral(is) de interesse à medida que são injetados ao longo de sua trajetória estereotáxica.
8. Posicione a câmera (Figura 3B) para exibir a parte superior da sonda eletrônica de malha dentro da agulha de vidro. Alguns softwares permitem que o usuário desenhe uma linha na tela para marcar a posição original da eletrônica da malha.
9. Inicie o fluxo ajustando a bomba da seringa para uma velocidade baixa e pressionando Iniciar. 10 mL/h é uma taxa de fluxo inicial típica para uma agulha capilar de 400 μm de diâmetro interno. Aumente lentamente a taxa de fluxo se a sonda eletrônica de malha não se mover dentro da agulha.
   nota: É importante minimizar o volume de fluido injetado no cérebro, pois isso pode danificar o tecido ao redor do local da injeção. Os melhores resultados são alcançados com volumes de injeção inferiores a 25 μL por 1 mm de comprimento de malha injetada. Os valores ideais são menos da metade desse volume; em nosso laboratório, normalmente injetamos 10–50 μL por um comprimento de malha injetado de 4 mm.
10. À medida que a sonda eletrônica de malha começa a se mover dentro da agulha, use a estrutura estereotáxica para retrair a agulha na mesma taxa com a qual a sonda eletrônica de malha está sendo injetada, usando a posição original marcada da eletrônica de malha como guia.
    nota: Este procedimento, denominado método de injeção de campo de visão (FoV), permite a entrega precisa de componentes eletrônicos de malha a uma região específica do cérebro sem amassar ou deslocar. Muitas vezes, a taxa de fluxo pode ser reduzida quando a sonda eletrônica de malha começa a se mover dentro da agulha. Em nosso laboratório, taxas de fluxo de 20 a 30 mL / h são frequentemente necessárias para superar o atrito estático entre a tela e as paredes da agulha capilar, mas a taxa pode ser reduzida para 10 mL / h uma vez iniciado o processo de injeção. As taxas de fluxo e os volumes de injeção são geralmente menores para agulhas capilares de diâmetro menor.
11. Continue fluindo solução salina e retraindo a agulha até que a agulha saia do crânio. Pare o fluxo da bomba de seringa.

2. Interface de entrada/saída

NOTA: Neste ponto, a sonda eletrônica de malha foi injetada a partir do ponto de partida desejado dentro do cérebro ao longo da trajetória escolhida. A agulha foi retraída e está logo acima da craniotomia com as interconexões eletrônicas da malha que vão do cérebro à agulha e as almofadas de entrada/saída (E/S) ainda dentro da agulha (Figura 4B). Esta seção usa uma placa de circuito impresso (PCB; Figura 4, Figura 5) para fazer interface com a sonda eletrônica de malha. O PCB conecta um conector ZIF a um conector amplificador padrão de 32 canais por meio de um substrato isolante que se torna o palco principal para experimentos de gravação neural. O PCB é personalizável para acomodar várias configurações de head-stage. Nossos arquivos de design estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos, meshelectronics.org, e podem ser usados para comprar PCBs de forma barata de fornecedores de serviços de fabricação e montagem de PCBs.

1. Use a estrutura estereotáxica para guiar cuidadosamente a agulha até o substrato de fixação FFC e através da lacuna, fluindo a solução com a bomba de seringa para gerar folga nas interconexões eletrônicas da malha (Figura 4C).
2. Quando a agulha estiver acima do substrato de fixação e através da lacuna, retome o fluxo rapidamente para ejetar as almofadas de E/S eletrônicas da malha no substrato de fixação (Figura 4D).
3. Usando uma pinça e uma pipeta de água deionizada (DI), dobre as almofadas de E/S em um ângulo de cerca de 90° o mais próximo possível da primeira almofada de E/S.
   nota: A dobra é necessária para permitir que as almofadas sejam inseridas no conector ZIF em uma placa de circuito impresso em uma etapa subsequente. O conector ZIF tem exatamente a mesma largura que os 32 pads de E/S da sonda eletrônica de malha, portanto, uma dobra imperfeita de 90°, ou uma dobra que não ocorre logo antes do primeiro pad de E/S, resultará na necessidade de cortar os pads de E/S (os pads mais à esquerda na Figura 4E).
4. Depois que as almofadas de E/S estiverem alinhadas, desdobradas e em um ângulo de 90° em relação à haste da malha, seque-as no lugar com ar comprimido fluindo suavemente.
   nota: As sondas eletrônicas de malha com menos de 32 canais podem ser conectadas com a mesma placa de interface de 32 canais. Por exemplo, nosso laboratório geralmente usa sondas eletrônicas de malha de 16 canais com PCBs de 32 canais. Isso fornece espaço extra dentro do conector ZIF, facilitando a interface, e os canais isolados adicionais são facilmente identificados como circuitos abertos por meio de testes de impedância durante as sessões de gravação.
5. Corte o clampsubstrato em uma borda reta aproximadamente 0.5–1 mm da borda das almofadas de E/S. Corte também as partes estranhas do clampsubstrato que impedirá a inserção no conector ZIF de 32 canais montado em PCB (Figura 4F).
6. Insira as almofadas de E/S no conector ZIF na placa de circuito impresso e feche a trava (Figura 4G). Use a eletrônica de medição para medir a impedância entre os canais e o parafuso de aterramento para confirmar a interface bem-sucedida. Se os valores de impedância forem muito altos, destrave o conector ZIF, ajuste a inserção e teste novamente até que a conexão bem-sucedida seja confirmada.
7. Cubra o conector ZIF e os componentes eletrônicos de malha exposta se interconectam com cimento dental para proteção. Vire o PCB na abertura do substrato e fixe o PCB com cimento no crânio do mouse (Figura 4H).
   nota: Dobrar o FFC na lacuna reduz a tensão mecânica que às vezes pode quebrar as interconexões eletrônicas da malha.
8. Deixe o cimento endurecer, transformando o PCB em um head-stage robusto e compacto para interface durante as sessões de gravação subsequentes (Figura 4I).

3. Experimentos de gravação neural

1. Coloque o mouse em um tailveiner ou outro restritor. Insira o préampPCB do amplificador no conector do amplificador padrão no PCB do estágio principal. Use um cabo separado para aterrar o parafuso de referência.
2. Para gravações restritas, deixe o mouse na restrição. Registre os dados usando o sistema de aquisição de dados pelo período desejado (Figura 5A).
3. Para gravações em movimento livre, solte o mouse do limitador após inserir o préampplaca de circuito impresso e aterrar o parafuso de referência. Registre pelo período de tempo desejado usando o sistema de aquisição de dados enquanto o mouse se comporta livremente (Figura 5B)

Results

Figura 1: Fotografias e imagens de microscópio óptico de componentes eletrônicos de malha plug-and-play.(A) Imagens de microscópio óptico lado a lado de uma sonda eletrônica de malha injetável com seringa com E/S plug-and-play. A sonda foi fotografada após a conclusão das etapas de fabricação na Figura 2, mas antes da liberação do substrato revestido com Ni. As caixa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quadro estereotáxico motorizado	Instrumentos de precisão mundiais	MTM-3	Para cirurgia estereotáxica de camundongo
Controlador de gravação de 512 canais	Intan Technologies	C3004	Um componente do sistema de registro neural
RHD2132 placa amplificadora	Intan Technologies	C3314	Um componente do sistema de registro neural
RHD2000 Cabo de interface SPI ultrafino de 3 pés	Intan Technologies	C3213	Um componente do sistema de registro neural
Limitador de mouse	Braintree Científico	TV-150 STD	Diâmetro interno padrão de 1,25 polegadas; usado para conter o mouse durante sessões de gravação restritas.
Agulhas capilares de vidro	Drummond Scientific Co.		Diâmetro interno 0,40 mm, diâmetro externo 0,65 mm. Outros diâmetros estão disponíveis.
Porta-micropipetas tipo U	Dispositivos Moleculares, LLC	1-HL-U	Usado para segurar as agulhas capilares de vidro durante a injeção estereotáxica
Seringa de 1 ml	NORM-JECT,® Henke Sass Wolf		Usado para carregamento manual de componentes eletrônicos de malha em agulhas capilares
Tubo de cateter intradêmico de polietileno	Becton Dickinson e Companhia		Diâmetro interno 1,19 mm, diâmetro externo 1,70 mm
Seringa de 5 mL	Becton Dickinson e Companhia		Usado na bomba de seringa para injeção de eletrônica de malha in vivo
Câmera ocular	Thorlabs Inc.	DCC1240C	Usado para visualizar a eletrônica da malha dentro das agulhas capilares durante a injeção
Software de aquisição de imagem ThorCam uc480 para câmeras USB	Thorlabs Inc.		Usado para visualizar a eletrônica da malha dentro das agulhas capilares durante a injeção
Bomba de seringa	Aparelho de Harvard	PHD 2000	Usado para fluir volumes precisos de solução através de agulhas capilares durante a injeção de componentes eletrônicos de malha
Broca odontológica EXL-M40	Osada	3144-830	Para perfurar a craniotomia
Broca de 0,9 mm	Ferramentas de Belas Ciências	19007-09	Para perfurar a craniotomia
Esterilizador de esferas quentes 14 cm	Ferramentas de Belas Ciências	18000-50	Usado para esterilizar instrumentos cirúrgicos
Instrumento de crioseccionamento CM1950	Leica Microsystems		Usado para cortar tecido congelado em seções. Muitas universidades têm
Grampo de extremidade em ângulo reto	Thorlabs Inc.	RA180/M	Usado para prender o porta-pipeta à estrutura estereotáxica
Placa de circuito impresso (PCB)	Circuitos Avançados		Usado para fazer interface entre a eletrônica de malha e a eletrônica de medição periférica, como o sistema de gravação Intan. A Advanced Circuits e outros fornecedores fabricam e montar PCBs com base nos arquivos de design fornecidos. Nossos arquivos de design de PCB estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos meshelectronics.org
Conector amplificador padrão de 32 canais	Conector Omnetics Corp.	A79024-001	Componente montado no PCB
Cabo flexível plano de 32 canais (FFC)	Molex, LLC	152660339	Usado como substrato de fixação ao fazer interface com almofadas de E/S eletrônicas de malha com o conector ZIF montado em PCB
Conector de força de inserção zero (ZIF) de 32 canais	Hirose Electric Co., LTD	FH12A-32S-0.5SH(55)	Componente montado no PCB