1. Injeção estereotáxica de eletrônica de malha no cérebro de camundongo vivo
NOTA: Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal com uma mistura de 75 mg/kg de cetamina e 1 mg/kg de dexdomitor. O grau de anestesia foi verificado com o método de pinça do dedo do pé antes do início da cirurgia. A temperatura corporal foi mantida colocando o camundongo em um cobertor homeotérmico a 37 °C sob anestesia. A técnica estéril adequada foi implementada para a cirurgia, incluindo, mas não se limitando a, autoclavagem de todos os instrumentos cirúrgicos de metal por 1 h antes do uso, usando luvas esterilizadas, usando um esterilizador de esferas quentes durante toda a cirurgia, a manutenção de um campo estéril ao redor do local da cirurgia, a desinfecção de instrumentos plásticos com etanol a 70% e a pele do couro cabeludo depilado foi preparada com iodóforo antes da incisão. Para cirurgias de sobrevivência, após a conclusão da cirurgia, pomada antibiótica foi aplicada ao redor da ferida e o camundongo foi devolvido a uma gaiola equipada com uma almofada de aquecimento a 37 °C. Os camundongos não foram deixados sozinhos até que recuperassem a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Os camundongos receberam analgesia com buprenorfina por injeção intraperitoneal na dose de 0,05 mg / kg de peso corporal a cada 12 h por até 72 h após a cirurgia. Os camundongos foram isolados de outros animais após a cirurgia. Os camundongos foram eutanasiados por meio de injeção intraperitoneal de pentobarbital na dose de 270 mg / kg de peso corporal ou por perfusão transcárdica.
- Anestesie o mouse e fixe-o em um quadro estereotáxico.
- Aplique lubrificante ocular nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento durante a anestesia.
- Use uma broca dentária e uma estrutura estereotáxica para abrir uma craniotomia nas coordenadas desejadas no crânio. Abra uma segunda craniotomia longe do local da injeção para a inserção de um parafuso ou fio de aterramento de aço inoxidável.
- Fixe um substrato de fixação ao crânio com cimento dentário. Corte uma lacuna de aproximadamente 1 mm de largura no substrato para melhorar a confiabilidade da etapa de dobra posteriormente no procedimento.
nota: Um cabo flexível plano (FFC) cortado em forma de "L" funciona bem (Figura 4A), embora muitos materiais funcionem desde que tenham a espessura correta para o conector de força de inserção zero (ZIF) de 32 canais (projetado para cabos de 0,18 ± 0,05 mm de espessura).
- Monte o porta-pipetas com a agulha contendo os componentes eletrônicos da malha na estrutura estereotáxica usando uma extremidade em ângulo reto clamp (Figura 2C e Figura 3A).
- Conecte a saída lateral do porta-pipeta a uma seringa de 5 mL presa em uma bomba de seringa (Figura 3D) usando um tubo capilar de aproximadamente 0.5–1 m de comprimento.
nota: Certifique-se de que não haja bolhas no tubo capilar antes de conectá-lo ao porta-pipeta. As bolhas podem interromper o fluxo durante a injeção e impedir uma entrega suave e controlada dos componentes eletrônicos da malha.
- Use a estrutura estereotáxica para posicionar a ponta da agulha no local inicial desejado dentro do cérebro.
nota: As sondas eletrônicas de malha usadas aqui são projetadas com eletrodos de registro espalhados por um comprimento de cerca de 2 mm e com o primeiro eletrodo localizado a cerca de 0,5 mm da borda inicial da malha eletrônica (borda mais à esquerda na Figura 1A). Por esse motivo, as coordenadas estereotáxicas devem ser selecionadas de forma que o local inicial seja 0,5 mm mais profundo que a região do cérebro de interesse. A propagação e a localização dos eletrodos de gravação dentro da eletrônica da malha podem ser selecionadas livremente durante o processo de design da máscara e devem ser selecionadas de forma que os eletrodos de gravação abranjam a(s) região(ões) cerebral(is) de interesse à medida que são injetados ao longo de sua trajetória estereotáxica.
- Posicione a câmera (Figura 3B) para exibir a parte superior da sonda eletrônica de malha dentro da agulha de vidro. Alguns softwares permitem que o usuário desenhe uma linha na tela para marcar a posição original da eletrônica da malha.
- Inicie o fluxo ajustando a bomba da seringa para uma velocidade baixa e pressionando Iniciar. 10 mL/h é uma taxa de fluxo inicial típica para uma agulha capilar de 400 μm de diâmetro interno. Aumente lentamente a taxa de fluxo se a sonda eletrônica de malha não se mover dentro da agulha.
nota: É importante minimizar o volume de fluido injetado no cérebro, pois isso pode danificar o tecido ao redor do local da injeção. Os melhores resultados são alcançados com volumes de injeção inferiores a 25 μL por 1 mm de comprimento de malha injetada. Os valores ideais são menos da metade desse volume; em nosso laboratório, normalmente injetamos 10–50 μL por um comprimento de malha injetado de 4 mm.
- À medida que a sonda eletrônica de malha começa a se mover dentro da agulha, use a estrutura estereotáxica para retrair a agulha na mesma taxa com a qual a sonda eletrônica de malha está sendo injetada, usando a posição original marcada da eletrônica de malha como guia.
nota: Este procedimento, denominado método de injeção de campo de visão (FoV), permite a entrega precisa de componentes eletrônicos de malha a uma região específica do cérebro sem amassar ou deslocar. Muitas vezes, a taxa de fluxo pode ser reduzida quando a sonda eletrônica de malha começa a se mover dentro da agulha. Em nosso laboratório, taxas de fluxo de 20 a 30 mL / h são frequentemente necessárias para superar o atrito estático entre a tela e as paredes da agulha capilar, mas a taxa pode ser reduzida para 10 mL / h uma vez iniciado o processo de injeção. As taxas de fluxo e os volumes de injeção são geralmente menores para agulhas capilares de diâmetro menor.
- Continue fluindo solução salina e retraindo a agulha até que a agulha saia do crânio. Pare o fluxo da bomba de seringa.
2. Interface de entrada/saída
NOTA: Neste ponto, a sonda eletrônica de malha foi injetada a partir do ponto de partida desejado dentro do cérebro ao longo da trajetória escolhida. A agulha foi retraída e está logo acima da craniotomia com as interconexões eletrônicas da malha que vão do cérebro à agulha e as almofadas de entrada/saída (E/S) ainda dentro da agulha (Figura 4B). Esta seção usa uma placa de circuito impresso (PCB; Figura 4, Figura 5) para fazer interface com a sonda eletrônica de malha. O PCB conecta um conector ZIF a um conector amplificador padrão de 32 canais por meio de um substrato isolante que se torna o palco principal para experimentos de gravação neural. O PCB é personalizável para acomodar várias configurações de head-stage. Nossos arquivos de design estão disponíveis mediante solicitação ou no site de recursos, meshelectronics.org, e podem ser usados para comprar PCBs de forma barata de fornecedores de serviços de fabricação e montagem de PCBs.
- Use a estrutura estereotáxica para guiar cuidadosamente a agulha até o substrato de fixação FFC e através da lacuna, fluindo a solução com a bomba de seringa para gerar folga nas interconexões eletrônicas da malha (Figura 4C).
- Quando a agulha estiver acima do substrato de fixação e através da lacuna, retome o fluxo rapidamente para ejetar as almofadas de E/S eletrônicas da malha no substrato de fixação (Figura 4D).
- Usando uma pinça e uma pipeta de água deionizada (DI), dobre as almofadas de E/S em um ângulo de cerca de 90° o mais próximo possível da primeira almofada de E/S.
nota: A dobra é necessária para permitir que as almofadas sejam inseridas no conector ZIF em uma placa de circuito impresso em uma etapa subsequente. O conector ZIF tem exatamente a mesma largura que os 32 pads de E/S da sonda eletrônica de malha, portanto, uma dobra imperfeita de 90°, ou uma dobra que não ocorre logo antes do primeiro pad de E/S, resultará na necessidade de cortar os pads de E/S (os pads mais à esquerda na Figura 4E).
- Depois que as almofadas de E/S estiverem alinhadas, desdobradas e em um ângulo de 90° em relação à haste da malha, seque-as no lugar com ar comprimido fluindo suavemente.
nota: As sondas eletrônicas de malha com menos de 32 canais podem ser conectadas com a mesma placa de interface de 32 canais. Por exemplo, nosso laboratório geralmente usa sondas eletrônicas de malha de 16 canais com PCBs de 32 canais. Isso fornece espaço extra dentro do conector ZIF, facilitando a interface, e os canais isolados adicionais são facilmente identificados como circuitos abertos por meio de testes de impedância durante as sessões de gravação.
- Corte o clampsubstrato em uma borda reta aproximadamente 0.5–1 mm da borda das almofadas de E/S. Corte também as partes estranhas do clampsubstrato que impedirá a inserção no conector ZIF de 32 canais montado em PCB (Figura 4F).
- Insira as almofadas de E/S no conector ZIF na placa de circuito impresso e feche a trava (Figura 4G). Use a eletrônica de medição para medir a impedância entre os canais e o parafuso de aterramento para confirmar a interface bem-sucedida. Se os valores de impedância forem muito altos, destrave o conector ZIF, ajuste a inserção e teste novamente até que a conexão bem-sucedida seja confirmada.
- Cubra o conector ZIF e os componentes eletrônicos de malha exposta se interconectam com cimento dental para proteção. Vire o PCB na abertura do substrato e fixe o PCB com cimento no crânio do mouse (Figura 4H).
nota: Dobrar o FFC na lacuna reduz a tensão mecânica que às vezes pode quebrar as interconexões eletrônicas da malha.
- Deixe o cimento endurecer, transformando o PCB em um head-stage robusto e compacto para interface durante as sessões de gravação subsequentes (Figura 4I).
3. Experimentos de gravação neural
- Coloque o mouse em um tailveiner ou outro restritor. Insira o préampPCB do amplificador no conector do amplificador padrão no PCB do estágio principal. Use um cabo separado para aterrar o parafuso de referência.
- Para gravações restritas, deixe o mouse na restrição. Registre os dados usando o sistema de aquisição de dados pelo período desejado (Figura 5A).
- Para gravações em movimento livre, solte o mouse do limitador após inserir o préampplaca de circuito impresso e aterrar o parafuso de referência. Registre pelo período de tempo desejado usando o sistema de aquisição de dados enquanto o mouse se comporta livremente (Figura 5B)
