Estabelecendo uma configuração de grampo de voltagem de célula inteira para registros eletrofisiológicos em fatias cerebrais

Resumo

Fonte: Sunstrum, J. K., et al. Avaliação da multiplicidade sináptica usando eletrofisiologia patch-clamp de células inteiras. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o posicionamento de uma pipeta pontiaguda perto de fatias de cérebro, formando um selo com uma célula neuronal. A sucção quebra a membrana celular, criando assim um grampo de remendo de célula inteira que permite medições de corrente para experimentos de eletrofisiologia.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Soluções

1. Solução de fatiamento
   1. Consulte a Tabela 1 para a composição da solução de fatiamento.
   2. Prepare uma solução de estoque 20x com antecedência e armazene-a a 4 °C por até 1 mês.
   3. Para a solução de fatiamento 1x, dissolva NaHCO₃, glicose e sacarose em ddH₂O e adicione o estoque 20x. Certifique-se de que a osmolaridade esteja entre 315 e 320 mOsm e armazene a solução por no máximo 1 semana a 4 °C.
   4. Encha dois copos com 100 mL de solução para fatiar e cubra-os com parafilme. Refrigerar a solução num congelador até ficar parcialmente congelada (aproximadamente 20 min num congelador a -80 °C). Usando um tubo de dispersão de gás, borbulhe ambos os copos da solução de fatiamento com 95% de O2 / 5% de CO2 por 20 min no gelo.
2. aCSF (líquido cefalorraquidiano artificial), para recuperação e manutenção de fatias
   1. Consulte a Tabela 1 para a composição do aCSF.
   2. Prepare uma solução de estoque 20x com antecedência e armazene-a a 4 °C por até 1 mês.
   3. Para 1x aCSF, dissolva NaHCO3 e glicose em ddH2O e adicione o estoque 20x. Certifique-se de que a osmolaridade esteja entre 298-300 mOsm. Use a solução dentro de 1 dia.
3. aCSF (baixo Ca²⁺ para gravação)
   1. Consulte a Tabela 1 para a composição do baixo Ca²⁺ aCSF.
   2. Prepare uma solução de estoque 20x com antecedência e armazene-a a 4 °C por até 1 mês.
   3. Para 1x baixo Ca²⁺ aCSF, dissolva NaHCO3 e glicose em ddH2O e adicione 20x (livre de CaCl2 e MgCl2), CaCl2 e MgCl2 às concentrações especificadas. Certifique-se de que a osmolaridade esteja entre 298-300. Use a solução dentro de 1 dia.
4. aCSF (Sr²⁺ para gravação)
   1. Consulte a Tabela 1 para a composição do Sr²⁺ aCSF.
   2. Prepare uma solução de estoque 20x com antecedência e armazene-a a 4 °C por até 1 mês.
   3. Para 1x Sr²⁺ aCSF, dissolva NaHCO3 e glicose em ddH2O e adicione 20x estoque (livre de CaCl2 e MgCl2), SrCl2 e MgCl2 às concentrações especificadas. Certifique-se de que a osmolaridade esteja entre 298-300. Use a solução dentro de 1 dia.
5. Solução interna
   1. Consulte a Tabela 1 para a composição da solução interna à base de K-gluconato.
   2. Para fazer 20 mL de solução interna, adicione 15 mL de água de grau de biologia molecular a um tubo de 50 mL. Em seguida, execute as etapas subsequentes no gelo.
   3. Preparar antecipadamente as seguintes soluções para concentrações de unidades populacionais de 1 M em água de grau de biologia molecular. Adicione (em mL): 2,32 K-gluconato, 0,24 Na-gluconato, 0,20 HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico), 0,16 KCl, 0,05 K_2-EGTA (Potássio etilenoglicol-bis(β-éter aminoetílico)-N,N,N',N',N'-ácido tetracético), 0,04 MgCl2 ao tubo de 50 mL.
   4. Adicionar 100 μL de 0,3 M Na₃GTP (sal de guanosina 5′-trifosfato de sódio)
   5. Pese 44,08 mg de K2 ATP (sal dipotássico de adenosina 5'-trifosfato) em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e adicione 1 mL de água de grau de biologia molecular e, em seguida, adicione a um tubo de 50 mL.
   6. Ajuste o pH para 7,2-7,4 com 1 M KOH. Certifique-se de que a osmolaridade esteja entre 283-289 mOsm.

2. Preparação da fatia

1. Preparar ferramentas
   1. Adicionar 200 ml de aCSF à câmara de recuperação (construída a partir de um copo de 250 ml com 4 poços e rede) e colocar a câmara de recuperação num banho-maria (35 °C).
   2. Cubra a câmara com um filme de parafina e borbulhe constantemente o aCSF com 95% de O2/5% de CO2 usando um tubo de dispersão de vidro por pelo menos 20 min.
   3. Configure as ferramentas de dissecção (bisturi, tesoura fina angular, pinça, pincel fino, colher de plástico).
   4. Encha uma seringa de 60 ml com aproximadamente 15 ml da solução de corte gelada do passo 1.1.4.
   5. Prepare a plataforma de dissecação colocando papel de filtro na tampa de uma placa de poço.
   6. Prepare a câmara de fatiar colocando-a na bandeja de gelo e enchendo a bandeja com gelo.
   7. Configure o vibratomo prendendo uma lâmina descartável no porta-lâminas.
   8. Para fazer uma pipeta de transferência, quebre a ponta de uma pipeta Pasteur e coloque um bulbo de borracha sobre a extremidade quebrada.
2. Dissecar o cérebro do rato
   1. Anestesiar o animal em uma câmara saturada com isoflurano a 4% até que os reflexos espinhais estejam ausentes.
   2. Decapite o animal usando uma guilhotina e remova rapidamente o cérebro.
      1. Faça uma incisão na linha média com uma lâmina de bisturi nº 22 de rostral para caudal.
      2. Lateralmente, descasque o couro cabeludo de cada lado da cabeça.
      3. Use uma tesoura fina para cortar o crânio de um lado de caudal para rostral (incluindo o lado dos ossos frontais), tomando cuidado para não danificar o cérebro.
      4. Use uma pinça para levantar o pedaço do crânio do cérebro e resfrie rapidamente o cérebro com 15 mL de solução de corte gelada usando a seringa da etapa 2.1.4.
      5. Levante o cérebro para fora do crânio.
      6. Coloque o cérebro em um dos copos cheios de solução de fatiamento gelada (da etapa 1.1.4) borbulhada com 95% de O2 / 5% de CO2.

3. Prepare fatias de hipotálamo de camundongo.

1. Bloqueie o cérebro para a área cerebral desejada e o ângulo de corte (por exemplo, para fatias hipotalâmicas coronais, apare o tecido rostral ao quiasma óptico e caudal à ponte usando uma lâmina e certifique-se de que o bloqueio caudal tenha uma superfície plana perpendicular à base do cérebro).
2. Usando um pedaço cortado de papel de filtro, pegue o cérebro do lado anterior e cole o lado posterior na placa de retenção usando cola instantânea.
3. Colocar rapidamente a placa de fixação na câmara de corte e enchê-la com a solução de corte do segundo copo no passo 1.1.4.
4. Prenda a câmara de fatiar e a bandeja de gelo no vibratome.
5. Defina a área de corte (anterior e posterior ao cérebro) e comece a fatiar cortes coronais de 250 μm de espessura. Parâmetros recomendados: velocidade 0,10 mm/s, amplitude 2 mm.
6. Apare as fatias no tamanho apropriado para a área cerebral desejada.
7. Recupere as fatias a 35 °C por 30-45 min. Em seguida, remova a câmara de recuperação do banho de aquecimento e deixe as fatias se recuperarem em temperatura ambiente por mais 30 minutos. Mantenha as fatias em temperatura ambiente pelo resto do dia e continue a borbulhar o banho constantemente com 95% de O2/5% de CO2.

3. Patch Clamp de célula inteiraGravação

1. Puxe as pipetas de remendo.​
   1. Usando os parâmetros sugeridos para o registro de células inteiras do manual do extrator de pipetas, puxe as pipetas de vidro de paredes espessas para uma resistência de pipeta de 3-5 MΩ.
   2. Usando uma microsseringa (comercial ou caseira), encha uma ponta de pipeta com uma solução interna filtrada. Para fazer uma micro seringa, queime a ponta de uma seringa de 1 mL e deixe a ponta cair, criando uma ponta longa e fina.
2. Obtenha a configuração de célula inteira.
   1. Coloque a pipeta de gravação logo acima da fatia e compense a corrente da pipeta no voltage clamp modo. Aplique uma leve pressão positiva na pipeta e trave a torneira.
   2. Selecione uma célula saudável com uma membrana intacta e aborde-a com a pipeta. A pressão positiva deve causar uma leve perturbação no tecido (ou seja, uma onda lenta no tecido ao entrar).
   3. Continue lentamente a aproximar a pipeta da célula usando um movimento diagonal até que a pipeta forme uma pequena covinha na superfície da célula.
   4. Solte a trava de pressão positiva. A célula começará a formar uma vedação e a resistência aumentará acima de 1 GΩ. No grampo de tensão, segure a célula em -68 mV.
   5. Afaste-se ligeiramente da célula na diagonal para remover o excesso de pressão da célula.
   6. Compense a capacitância rápida e lenta da pipeta.
   7. Aplique uma breve sucção através do tubo conectado ao porta-pipeta para romper a célula e obter uma configuração de célula inteira.
   8. Mude para o modo Cell na janela de teste de membrana em um software de aquisição e análise de dados de eletrofisiologia (por exemplo, Clampex).
   9. Antes de cada registro de grampo de tensão, execute um teste de membrana usando o mesmo software e registre os parâmetros relevantes em um livro de laboratório (resistência da membrana, resistência de acesso e capacitância).
   10. Mantenha a temperatura do banho de registro em 27–30 °C e a vazão em 1.5–2.0 mL/min para experimentos subsequentes.

Tabela 1: A composição de várias soluções.

	Concentrações da solução (mM)
	Cortar	ACSF normal	Baixo Ca2+ aCSF	Sr+ aCSF	Pipeta/Interna
NaCl	87	126	126	126	-
Kcl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0,5	2.5	0,5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	algarismo
NaH2PO4	1.25	1.25	1.25	1.25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
glicose	25	10	10	10	-
sacarose	75	-	-	-	-
K-gluconato	-	-	-	-	116
Na-gluconato	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0,3

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 ml	Bd	309659
10 lâmina	Fisher Scientific/outros	Rolamento 35698
lâmina 22	VWR/outros	Rolamento 21909-626
Filtros de seringa de 22 uM	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Instrumentos de Harvard	Nº 72-8547
Tesoura afiada angular	Instrumentos de Harvard	72-8437
Clampex	Dispositivos Moleculares	pClamp 10
Lâmina de borda dupla	VWR	Pedido 74-0002
Papel de filtro	Sigma/outros	1001090
Pincel fino	Fisher/vários	15-183-35/vários
Tubo de dispersão de gás	VWR	LG-8680-120
Isoflurano	Fresenius Kabi/outros	M60303
Cola Krazy	vário	vário
Mini análise	Synaptosoft	MiniAnálise 6
Osmomoter	Wescor Inc	Modelo 5600
Parafilme	sigma	PM-996
Pipeta Pasteur	VWR	14672-200
medidor de pH	Mettler Toledo	FE20-ATC
Bulbo de borracha	VWR	82024-550
Cabo de bisturi nº 3	Instrumentos de Harvard	72-8350
Cabo de bisturi nº 4	Instrumentos de Harvard	Telefone: 72-8356
Lâmina de borda única	VWR	Rolamento 55411-050
Fatiador de vibratome	Leica	VT1200S
Sistema de purificação de água	Millipore	Milli-Q Acadêmico A10
Tampa da placa do poço	Fisher/vários	07-201-590/vários
CaCl2 2H2O	sigma	C7902
CdCl2	sigma	202908
EGTA	sigma	E3889
glicose	sigma	G5767
HEPES	sigma	H3375
K2-ATP	sigma	Rolamento A8937
Kcl	sigma	Pág. 9333
K-gluconato	sigma	G4500
MgCl2 6H2O	sigma	M2670
Água de grau de biologia molecular	sigma	W4502-1L
Na3GTP	sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconato	sigma	S2054
NaH2PO4	sigma	Rolamento 71504
NaHCO3	sigma	S6014
Picrotoxina	sigma	Pág. 1675
SrCl	sigma	255521
sacarose	Bioshop	SUC507.1