Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. pHuC_Mermaid Geração de plasmídeo
NOTA: Mermaid é um biossensor desenvolvido emparelhando o domínio de detecção de tensão (VSD) do sensor de tensão Ciona intestinalis (agora Ciona robusta) contendo fosfatase (Ci-VSP) com os fluoróforos parceiros de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) Umi-Kinoko Green (mUKG: doador) e uma versão monomérica da proteína fluorescente emissora de laranja Kusabira Orange (mKOk: aceitador). Para este biossensor, as alterações conformacionais do domínio VSD, induzidas pela despolarização da membrana, aumentam a proximidade das proteínas fluorescentes doadoras e aceitadoras, aumentando assim a transferência de energia entre elas (aumentando a razão FRET). O VSD garante a localização eficiente do biossensor na membrana plasmática. A expressão neuronal do biossensor (na medula espinhal, o sinal é detectável em interneurônios e neurônios motores) é alcançada pela clonagem do quadro de leitura aberto da sereia (ORF) sob o promotor pan-neural do peixe-zebra HuC.
- Amplificar por reação em cadeia da polimerase (PCR) o quadro de leitura aberto Mermaid (ORF) do plasmídeo pCS4+ Mermaid com Pfu (revisão) DNA polimerase usando o primer T3 Universal e o primer Mermaid SmaI (5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) para inserir um local de restrição SmaI a montante do Mermaid ORF.
- Use a seguinte mistura de PCR: 0,5 μL de Pfu DNA polimerase, 7,5 μL do tampão específico 10x, 1 μL de 10 mM de trifosfatos de desoxinucleotídeos (dNTPs), 2,5 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,5 μL (50 ng) da preparação de plasmídeo e 1 μL de 20 μM de soluções-mãe de cada primer em um volume total de 50 μL.
- Aquecer a mistura de PCR durante 15 s a 95 °C, preparar durante 15 s a 50 °C e alongá-la durante 4 min a 72 °C durante um total de 35 ciclos.
- Purificar em gel o produto de PCR sem corte específico usando um kit comercial de purificação de gel, seguindo o protocolo do fabricante.
- Clone o fragmento de DNA no vetor rombudo pCMV-SC seguindo o protocolo do fabricante.
- Linearize o plasmídeo positivo para sereia (denominado pCMV-SC_Mermaid) com a enzima de restrição SmaI para a inserção seguinte do promotor HuC.
- Estabelecer a reacção de restrição da seguinte forma: 0,5 μL (10 U) de enzima de restrição SmaI, 2 μL do tampão 10x do kit e 5 μg de ADN plasmidial num volume total de 20 μL. Incubar a reacção a 25 °C durante 1 h.
- Purificar o plasmídeo digerido em gel usando um kit comercial de purificação de gel seguindo o protocolo do fabricante.
- PCR-amplificar o promotor HuC (pHuC), com DNA polimerase Pfu e DNA genômico de peixe-zebra como modelo, usando um par de primers específicos para HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA e HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) e abrangendo uma região de 3.150 pb a montante do ATG.
- Configure a mistura de PCR usando o seguinte esquema: 0,5 μL de DNA polimerase de Pfu, 7,5 μL do tampão específico 10x, 1 μL de 10 mM dNTPs, 2,5 μL de DMSO, 200 ng de DNA genômico e 1 μL de soluções estoque de 20 μM de cada primer em um volume total de 50 μL.
- Após uma etapa inicial de 2 min a 95 °C, aqueça a mistura de PCR por 15 s a 95 °C, prepare-a por 15 s a 50 °C e alongue-a por 4 min a 72 °C por um total de 35 ciclos.
- Purifique o produto de PCR sem corte específico usando um kit de purificação de gel comercial seguindo o protocolo do fabricante.
- Ligue uma quantidade equimolar do pCMV-SC_Mermaid purificado (etapa 1.5) e do DNA pHuC (etapa 1.7) usando 1 μL de T4 DNA ligase e 1 μL do tampão específico 10X em um volume total de 10 μL. Incubar a reação por 16 h a 4 ° C.
- Transformar uma alíquota de células competentes com 5 μL da reacção de ligação (passo 1.8) seguindo as instruções do fabricante.
- Selecione os clones positivos para pHuC (pHuC_Mermaid) com o promotor inserido na orientação adequada por uma digestão dupla Sal I-EcoRV (o local de restrição Sal I foi inserido a montante do fragmento promotor na etapa 1.6, enquanto o local de restrição EcoRV está posicionado a jusante da região de poliadenilação, PolyA, do plasmídeo pCMV-SC).
- Configure a reação de restrição da seguinte forma: 0,5 μL (10 U) de enzimas de restrição SalI e EcoRV, 2 μL do tampão kit10X e 1 μg de DNA pHuC_Mermaid em um volume total de 20 μL. Incube a reação a 37 ° C por 1 h. Execute as reações em um gel de agarose.
2. Microinjeção de embriões
- Transfira os ovos fertilizados obtidos do peixe-zebra adulto do tipo selvagem (cepa AB) ou Sod1-G93R para uma placa de Petri de 10 mm usando uma pipeta de plástico.
- Lave os embriões em água fria (4 °C) e microinjete-os imediatamente na gema com 200 pg de plasmídeo pHuC_Mermaid usando um microinjetor (para uma descrição geral e detalhada do procedimento de microinjeção).
- Usando uma pipeta de plástico, transfira os embriões para uma placa de Petri e incube-os em água de peixe a 28 °C até atingirem o estágio de desenvolvimento desejado (20-24 h pós-fertilização, hpf) para as seguintes análises.
3. Análise espontânea de enrolamento da cauda
NOTA: Avalie o comportamento espontâneo de enrolamento da cauda em 20-24 embriões hpf com ou sem a droga riluzol.
- Transfira um embrião para uma placa de Petri redonda de 90 mm cheia de água de peixe contendo 0,2% de DMSO (veículo riluzol) e descorione-o manualmente usando duas pinças de joalheiro com pontas afiadas. Incube o embrião por 5 min.
- Detecte o enrolamento da cauda à temperatura ambiente (RT) durante uma gravação de vídeo de 1 minuto usando uma câmera digital montada em um estereomicroscópio. Adquira séries temporais com resolução de tempo de 30 quadros/s.
- Calcule a frequência de enrolamentos espontâneos da cauda contando o número de curvas (contralateral e ipsilateral) por unidade de tempo.
- Para avaliar o efeito do medicamento riluzol, use suavemente uma pipeta Pasteur de plástico para transferir o embrião para uma nova placa de Petri de 90 mm cheia de água de peixe contendo 5 μM de riluzol.
- Incube o embrião por 5 minutos antes de gravar um vídeo de 1 minuto e realizar a análise comportamental como acima.
4. Configuração de imagem para visualização de biossensores de sereia em embriões vivos: detecção simultânea de sinais de doadores e aceitadores
- Montar os embriões de 20 a 24 hpf em agarose de baixo ponto de fusão a 1% em água de peixe a 37 °C dentro de uma placa de imagem com fundo de vidro de 35 mm. Oriente os embriões de lado. Espere até que a agarose solidifique à temperatura ambiente.
- Transfira a placa de imagem para o estágio de um confocal invertido montado em um microscópio invertido. Identifique neurônios motores que expressam o biossensor com uma objetiva de 20X (abertura numérica de 0,7, NA) excitando o mUKG com a linha de laser de argônio de 488 nm e registrando sua emissão entre 495 e 525 nm.
- Para uma medição FRET, excite mUKG, o doador do par FRET, com a linha de laser de 488 nm. Detecte simultaneamente, com um scanner ressonante operando a 8.000 Hz no modo bidirecional, a fluorescência emitida pelo doador (entre 495 e 525 nm) e a fluorescência emitida pelo aceptor mKOk (entre 550 e 650 nm, canal FRET). Se disponível, use o laser.
de 473 nm
nota: A eficiência de excitação do doador será ligeiramente reduzida (85% em vez de 93% com 488 nm), mas a excitação cruzada do aceptor também será reduzida (de 17% com a linha de laser de 488 nm para 9% com a linha de laser de 473 nm).
- Para reduzir a fototoxicidade e o branqueamento do fluoróforo, minimize a iluminação da amostra reduzindo a potência da linha de laser (na janela do caminho do feixe do software de aquisição).
- Otimize a excitação para corresponder aos parâmetros de ganho e deslocamento definidos no início do experimento e mantidos constantes durante toda a sessão. Para definir o deslocamento, altere a cor da imagem para valores de intensidade (usando a tabela de pesquisa Q) e, enquanto digitaliza com o laser desligado, gire o botão de deslocamento (deslocamento inteligente) para que os pixels de fundo tenham uma intensidade ligeiramente superior a zero. Com a mesma tabela de look-up, ligando o laser durante a digitalização, gire o botão de ganho (ganho inteligente) para maximizar a relação sinal-ruído, tomando cuidado para evitar pixels saturados.
- Usando um orifício aberto (2 unidades arejadas), adquira imagens de 16 bits para fornecer uma faixa dinâmica suficiente para análises quantitativas. Evite a média para aumentar a velocidade de aquisição e minimizar o fotobranqueamento.
- Na janela de aquisição de software, selecione um tamanho de campo de imagem de 512 x 64 pixels (tamanho do pixel: 605 nm) no menu suspenso.
- Na janela do modo de aquisição, selecione xyt (lapso de tempo em um único plano xy) no menu suspenso e registre as mudanças na voltagem do neurônio espinhal do embrião adquirindo um único plano xy, definindo os parâmetros de aquisição para registrar uma imagem a cada 30 ms por 1 min.
- Para avaliar o efeito da administração de riluzol na despolarização da membrana no mesmo neurônio, adquira um novo conjunto de dados 5 min após a adição de água de peixe contendo 5 μM de riluzol.
- Para análise de FRET, use a macro ImageJ Biosensor_FRET (expressando biossensores FRET de cadeia única).
- Avalie a razão FRET da membrana basal de cada neurônio em t1 como ((FRET média - fundo FRET)/(Média do doador - fundo do doador)), onde FRET e intensidade média do doador é a intensidade média de fluorescência calculada na mesma região de interesse (ROI) desenhada ao redor da célula para cada canal adquirido e FRET e fundo do doador é a intensidade média de fluorescência calculada em uma ROI do campo de visão sem a amostra fluorescente.
nota: Uma descrição detalhada passo a passo do uso do plug-in pode ser encontrada no site da www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret.
- Use um software gráfico para comparar a frequência, amplitude e duração da despolarização entre diferentes paradigmas experimentais. Compare dois grupos usando um teste t de Student não pareado e considere os valores médios como estatisticamente diferentes quando P <0,05.
