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Artigo de método

Uma abordagem não invasiva para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra

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⸱

8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

Fonte: Benedetti, L., et al. Potencial de membrana do neurônio motor biossensorial em embriões vivos de peixe-zebra. J. Vis. (2017).

Este vídeo demonstra um ensaio não invasivo para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra. Ao medir o enrolamento da cauda nos embriões como resultado da despolarização espontânea dos neurônios motores da medula espinhal, um bloqueador dos canais de sódio é aplicado para reduzir a frequência de enrolamento Em seguida, os embriões são imobilizados em agarose e colocados sob um microscópio de fluorescência. Os neurônios motores geneticamente modificados expressam um biossensor de detecção de voltagem com um doador e um fluoróforo aceitador. Uma diminuição na emissão do fluoróforo aceitador indica uma redução na despolarização espontânea dos neurônios motores devido ao bloqueador dos canais de sódio.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. pHuC_Mermaid Geração de plasmídeo

NOTA: Mermaid é um biossensor desenvolvido emparelhando o domínio de detecção de tensão (VSD) do sensor de tensão Ciona intestinalis (agora Ciona robusta) contendo fosfatase (Ci-VSP) com os fluoróforos parceiros de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) Umi-Kinoko Green (mUKG: doador) e uma versão monomérica da proteína fluorescente emisso....

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Baixo ponto de fusão AgaroseSigma-AldrichA9414
DmsoSigma-AldrichW387520
RiluzolSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ DNA polimeraseAgilent Technologies - Divisão de Produtos Stratagene600389
T3 Primer universalSigma-Aldrich
Sistema de limpeza de gel e PCR Wizard SVPromegaA9280
Primer universal SmaIEurofins
Sistema de vetor de expressão de mamíferos StrataClone / vetor rombudo pCMV-SCAgilent Technologies - Divisão de Produtos Stratagene240228
SmaIBiolabs da Nova InglaterraR0141S
DNA ligase T4PromegaM1801
SaliBiolabs da Nova InglaterraR0138S
EcoRVBiolabs da Nova InglaterraR0195S
35 mm, prato de imagem com fundo de vidroIbidiRolamento 81151
fórcepsSigma-AldrichF6521
EstereomicroscópioLeica MicrosystemsM10 F
Câmera digitalLeica MicrosystemsDFC 310 FX
Software Leica Application Suite 4.7.1Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4maçã
Microscópio confocal (invertido)Leica MicrosystemsTCS SP5
MicroinjetorEppendorfFemtojet
ImageJ macro Biosensor_FRET
GraphPad Prism 6.0cGraphPad Software, Inc

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