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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação e Anestesia Animal
- Induza a anestesia no camundongo com inalação de isoflurano / oxigênio. Use 4% de isoflurano para a indução da anestesia e 2-3% para a manutenção do fluxo de oxigênio de 2,5 L/min. Ajuste a porcentagem de isoflurano para a manutenção da anestesia de acordo com a condição do camundongo, ou seja, camundongos pequenos e fracos requerem menos anestésicos. Confirme a anestesia adequada, por exemplo, aplicando uma leve pressão na almofada de caminhada dos membros posteriores para verificar a ausência de um reflexo de retirada da dor.
- Controle a temperatura corporal do mouse usando uma placa de aquecimento termostático a 37 °C para evitar a diminuição da temperatura corporal durante a anestesia.
- Encaixe o mouse com o nariz para manutenção da anestesia. Certifique-se de que o animal tenha oxigênio suficiente, verificando se o nariz não bloqueia as vias aéreas e se o animal está respirando de forma constante.
- Durante a gravação, monitore se o mouse está suficientemente anestesiado, observando a frequência respiratória (aproximadamente 1 Hz na anestesia) e a ausência de reflexo de retirada com pressão leve. Aumente a concentração de isoflurano manualmente se a anestesia não for profunda o suficiente.
- Após as medições, deixe o mouse se recuperar na placa de aquecimento ou no calor de uma lâmpada infravermelha até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal, por aproximadamente 2-5 min. Não deixe o rato sozinho e na companhia de outros ratinhos até que tenha recuperado totalmente da anestesia.
2. Medição de CMAP em membros torácicos
- Use os eletrodos de agulha de 27 G para medições CMAP do membro anterior. Consulte a Figura 1 para obter os locais recomendados de posicionamento do eletrodo.
- Coloque eletrodos nos membros anteriores da seguinte maneira.
- Posicione o mouse na almofada de aquecimento em decúbito dorsal e use fita adesiva para estender os dois membros anteriores nas laterais do corpo (Figura 1B).
- Coloque os eletrodos estimulantes (1 = ânodo e 2 = cátodo) por via subcutânea em ambos os lados do membro anterior para alinhar com o nervo do plexo braquial. Levante a pele para inserir a agulha perpendicularmente através da pele e empurre aproximadamente 5 mm da agulha sob a pele sem perfurar os músculos subjacentes.
- Coloque o eletrodo de registro (3) por via subcutânea em cima do músculo bíceps braquial, levantando a pele. Coloque o eletrodo de referência (4) nas almofadas de caminhada em 3 mm de profundidade em um ângulo de 30 graus. Coloque o eletrodo de aterramento (5) subcutaneamente na lateral do mouse.
nota: Os eletrodos estão próximos uns dos outros nesta configuração. Evite que os eletrodos se toquem, pois isso distorce a gravação.
3. Aquisição de dados
- Inicie a estimulação pressionando o botão de estímulo recorrente na unidade controladora e gire o botão do controlador de intensidade para aumentar o estímulo. Estimule todos os axônios usando 1 pulso/s com duração do estímulo de 0,1 ms. Selecione a frequência e a duração corretas nos menus suspensos do software.
- Para atingir estímulos supramáximos (5-20 mA; em condições desmielinizantes até 60 mA), aplique estímulos crescentes girando o botão do controlador de intensidade até que a amplitude da resposta CMAP pare de aumentar. A partir daí, aumente ainda mais o estímulo em 20% para garantir que a amplitude do CMAP tenha atingido sua resposta máxima. Termine a estimulação pressionando o botão de estímulo recorrente novamente.
- Use a ferramenta de marcação para indicar os seguintes pontos no registro: início do estímulo, início da resposta, pico positivo máximo e pico negativo máximo (Figura 2).
- Determine a latência (em ms) como um atraso desde o início do estímulo até o início da resposta (Figura 2). Defina o início da resposta como o ponto mais antigo em que a amplitude começa a aumentar. Use a latência para avaliar a desmielinização nos axônios.
- Meça a amplitude (mV) do pico máximo negativo ao pico máximo positivo (Figura 2). Use a magnitude da amplitude para correlacionar o número de axônios funcionais.
