Registro eletrofisiológico das respostas de voltagem de fotorreceptores retinianos de Drosophila a estímulos luminosos

Resumo

Fonte: Juusola, M., et al. Método eletrofisiológico para registro de respostas de voltagem intracelular de fotorreceptores de Drosophila e interneurônios a estímulos luminosos in vivo. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo descreve o protocolo para registro eletrofisiológico da atividade fotorreceptora no olho de uma Drosophila imobilizada, permitindo a medição precisa das mudanças de voltagem em resposta a estímulos luminosos.

Protocolo

1. Gravação de fotorreceptores R1-R6

1. Esteja sempre aterrado ao operar o microeletrodo amplifier (por ex.ample tocando a superfície metálica da gaiola de Faraday ou mesa antivibração), pois isso impede que se forneça acidentalmente uma carga estática ao head-stage, o que pode danificar o circuito.
2. Ilumine o mastro da plataforma de preparação de moscas de cima com duas guias de luz pescoço de ganso (Figura 1A) (com a fonte de luz fria dentro da gaiola de Faraday) para que o porta-moscas possa ser colocado no mastro na posição preferida sob controle visual rigoroso.
3. Monte o porta-moscas (com a mosca nele!) no poste da plataforma de preparação de moscas. Gire o porta-moscas de forma que o olho esquerdo da mosca fique diretamente voltado para o investigador (Figura 1B).
4. Insira o eletrodo de referência rombudo suavemente através dos ocelos da mosca na cápsula da cabeça usando um pequeno micromanipulador grosso enquanto observa a preparação através do estereomicroscópio (Figura 1C). Não empurre o eletrodo muito fundo, pois isso pode danificar o cérebro da mosca.
   1. Como alternativa, insira o eletrodo de referência na parte de trás do tórax. Certifique-se sempre de que a mosca pareça saudável (move suas antenas) e que seus olhos estejam intactos, não danificados acidentalmente. Se a preparação parecer menos do que imaculada, prepare uma nova mosca para os experimentos.
5. Dirija o microeletrodo de gravação afiado no olho esquerdo através de uma pequena abertura coberta de vaselina. Use alta ampliação no estereomicroscópio e mova as guias de luz e o plano focal para que a localização da ponta do eletrodo se torne aparente em 3D por seus padrões de refletância.
   NOTA: A Figura 1D mostra como a cabeça da mosca deve ser posicionada (em relação ao ângulo em que o microeletrodo de gravação entra no olho) para gravações de fotorreceptores. Cravar o eletrodo no olho sem quebrá-lo é a fase mais difícil do experimento. Se a ponta do eletrodo errar a pequena abertura no olho, atingindo a córnea, ela normalmente quebra.
6. Ligue o amplificador de microeletrodo assim que ambos os eletrodos estiverem firmemente dentro da preparação, em contato elétrico com os fluidos corporais da mosca.
7. Desligue a fonte de luz fria (dentro da gaiola de Faraday) e desconecte-a da rede elétrica. Conecte seu plugue ao aterramento central para minimizar o ruído elétrico induzido pelo loop de aterramento e afaste as guias de luz do pescoço de ganso para que o sistema Cardan-arm possa ser movido livremente ao redor da mosca. Desligue as luzes da sala para garantir que a preparação da mosca esteja agora em relativa escuridão.
8. Meça a resistência do eletrodo de registro no olho. Use apenas eletrodos de gravação com resistência de 100 a 250 MΩ.
   nota: Obter registros intracelulares de alta qualidade por eletrodo de <70 MΩ é praticamente impossível. Se a resistência for <80 MΩ, é provável que a ponta do eletrodo esteja quebrada. Neste caso, desligue o amplificador e troque o eletrodo de gravação.
9. Defina o amplificador para corrente-clamp (CC) ou modo de gravação em ponte. Cancele qualquer diferença de tensão arbitrária entre os eletrodos de gravação e de referência, pois ambos estão agora descansando no espaço extracelular eletricamente interconectado, definindo o deslocamento do sinal (tensão de gravação) para zero. Siga as alterações de deslocamento do sinal usando a leitura do visor do amplificador ou uma tela do osciloscópio.
10. Aguarde 2-3 minutos para que o olho da mosca se adapte ao escuro.
11. Conduza a ponta do eletrodo de gravação mais profundamente no olho com pequenos passos de 0.1 a 1 mícron. Faça isso com um piezo-passo do eixo x de um micromanipulador controlado remotamente ou girando suavemente o botão de resolução fina de um manipulador manual.
12. Estimule o olho da mosca com breves flashes de luz (1 a 10 ms) enquanto o eletrodo de registro está sendo avançado no tecido.
    nota: Se o eletrodo de registro estiver posicionado na retina e o olho funcionar normalmente, cada flash de luz causará uma breve e pequena queda na tensão (hiperpolarização de 0,2 - 5 mV), chamada de eletrorretinograma (ERG). Essa mudança no potencial de campo do espaço extracelular é causada pela resposta coletiva das células da retina à luz.

Resultados

Figura 1. Posicionamento do porta-moscas e dos eletrodos para os experimentos. (AB) O porta-moscas é colocado na plataforma de gravação que também fornece controle de temperatura por meio de um elemento Peltier (A: plataforma redonda branca no centro). O braço de Cardan permite o posicionamento exato do estímulo de luz a uma distância igual (via rotação x, y) ao redor da mosca, com a fonte de luz (um...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio estéreo com zoom para fazer a preparação da mosca	Olimpo	Oculares SZX12 DFPLFL1.6x PF: WHN30x-H/22	Capaz de ampliação de ~ 150X com longa distância de trabalho; suporte de montagem em mesa de aço pesado sob medida
Estereomicroscópio na configuração intracelular	· Olimpo	Olympus SZX7; oculares: WHN30x-H/22	As oculares 30X são necessárias para ver bem os reflexos da ponta do eletrodo ao conduzi-lo através do pequeno orifício da córnea para o olho
Microscópio Nikon	Nikon SMZ645; oculares: C-W30x/7
Mesa antivibração	Melles Griot	Com furos métricos M6 na placa de ensaio	Nossas plataformas sob medida têm um grande orifício perfurado na placa de ensaio grossa que permite a entrada do poste da plataforma de preparação de moscas (abriga um dissipador de calor de cobre com componentes eletrônicos) por baixo
Newport
Micromanipuladores	Narishige	Narishige NMN-21	Em nossas configurações intracelulares, diferentes sistemas de micromanipuladores são usados para conduzir os eletrodos de gravação de shap no olho da mosca. Todos os manipuladores listados estão fornecendo com sucesso gravações estáveis de longa duração de fotorreceptores de Drosophila e LMCs.
Huxley Bertram	Eixo xyz Huxley com controle manual fino
Sensapex	Eixo triplo Sensapex
Märzhäuser	Märzhäuser DC-3K com stepper piezo de eixo x adicional e controlador MS 314
Suportes magnéticos	Qualquer base magnética com interruptor liga/desliga serve		Por exemplo, para gerenciar cabos dentro da gaiola de Faraday
Suportes de eletrodos	Aparelho de Harvard	ESP/W-F10N
Fio de prata	Instrumentos de precisão mundiais	AGW1510	0,3 - 0,5 mm de diâmetro; precisa ser cloridizado para os porta-eletrodos
Fonte luminosa da fibra ótica	Muitos diferentes, incluindo o Olimpo
Feixes de fibra óptica	Tecnologia UltraFine		Para fornecer o estímulo de luz LED ao sistema de braço Cardan. Usamos guias de luz líquida e de quartzo (variam de UV a IR)
Laboratórios Thorn
Tubo de cateter de mosca		P80-50P 50ml Cent. Tubo PP., Pacote de 100 Pcs	Corte o fundo cônico do tubo de centrífuga de plástico de 50 ml e cole uma ponta de pipeta de 1 ml nele.
Sistema de Aquisição Digital	Instrumentos nacionais
Amplificador de microeletrodo de corrente/tensão de eletrodo único	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ produtos/amplificadores/seg-single- electrode-clamp/sec-10lx.html	Excelente desempenho!
Palco principal	Padrão (+/- 150 nA)	Para npi SEC-10LX
Fontes de luz LED e drivers	OptoLED de 2 canais (Cairn Research Ltd., Reino Unido)		Muitos de nossos sistemas de estímulo são construídos internamente
Auto-projetado e construído
Software de Aquisição e Análise	Muitas empresas para escolher		Biosyst; sistema baseado em Matlab escrito sob medida para trabalho experimental e teórico no laboratório de Juusola
Computador pessoal ou Mac			Certifique-se de que o PC ou Mac seja compatível com o sistema e software de aquisição de dados
Sistema de braço cardan	Auto-projetado e construído		Fornecendo posicionamento x, y, z preciso dos estímulos luminosos
Sistema de controle de temperatura Peltier	Auto-projetado e construído
Gaiola de Faraday	Auto-construído		Blindagem contra ruído eletromagnético
Capilares de vidro borossilicato filamentado		Diâmetro externo: 1 mm
Diâmetro interno: 0,5 - 0,7 mm
Capilares de vidro de quartzo filamentado		Diâmetro externo: 1 mm
Diâmetro interno: 0,5 - 0,7 mm
Extrator de pipetas	Companhia de Instrumentos Sutter	Extrator de micropipeta a laser modelo P-2000 flamejante/marrom	Para eletrodos de referência de borossilicato, use o programa predefinido #11 (eletrodos de remendo): Calor = 350; Filamento = 4; Velocidade 36; Atraso = 200).1.2.1). Para eletrodos de gravação de borossilicato, use o programa predefinido #12 (isso normalmente puxa bons sharps convencionais para gravações de fotorreceptores): Calor = 355; Filamento = 4; Velocidade 50; Atraso = 225; Puxe = 150. Para gravações LMC, que requerem eletrodos com pontas mais finas, esses valores precisam ser ajustados. Para puxar capilares de quartzo, o manual P-2000 sugere programas para microeletrodos de ponta fina. Os parâmetros predefinidos desses programas servem como pontos de partida úteis para modificações sistemáticas para gerar eletrodos com bom sucesso de penetração e baixo ruído de gravação.
Solução de Ringer Extracelular para o eletrodo de referência	Produtos químicos da Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, sacarose	Veja a receita na seção de protocolo
Solução de KCl 3 M para enchimento do microeletrodo de registro filamentoso	Sais da Fisher Scientific	10010310, KCl
vaselina	Vaselin