Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Resumo

Fonte: Lunsford, E. T., et al. Atividade dos neurônios aferentes da linha lateral posterior durante a natação em peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra paralisada, posicionando uma micropipeta perto do gânglio da linha lateral e formando uma vedação solta para captura de sinal. A solução extracelular mantém a viabilidade neuronal durante esse processo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de materiais para registros eletrofisiológicos

1. Faça um prato de gravação com fundo de elastômero de silicone.
   1. Dispense uma fina camada de componentes de elastômero de silicone auto-misturados (por exemplo, Sylgard) em uma placa de cultura de tecidos com fundo de vidro de cobertura até que fique nivelada com a borda de um poço raso. Aproximadamente 0,5 mL é suficiente.
   2. Cubra e catalise o prato por no mínimo 48 h ....

Resultados

Figura 1: Registro eletrofisiológico simultâneo do neurônio aferente da linha lateral posterior e da atividade da raiz motora ventral. (A). Exemplo de eletrodos de registro de aferente (i) e raiz motora ventral (ii) de mancha solta. As barras de escala representam 50 μm. (B) As larvas de peixe-zebra são paralisadas e fixadas em quatr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Copo de 100 mL	Pyrex	1000	Receptáculo para engrenagem
Objetiva de imersão em água 10x	Olimpo	UMPLFLN10xW	Baixa ampliação para posicionamento de larvas e eletrodo de registro
Objetiva de imersão em água 40x	Olimpo	LUMPLFLN40XW	Maior ampliação para posicionar a ponta do eletrodo e estabelecer o patch-clamp
Cabos coaxiais BNC	ThorLabs	2249-C-12	Conectando canais de amplificador e digitalizador; requer 4
Capilares de vidro borossilicato c/ filamento	Warner Instruments	G150F-3	Diâmetro interno: 0,86, diâmetro externo: 1,50; vidro capilar usado para formar eletrodos de gravação
computador	N/A	N/A	Qualquer computador deve funcionar
Fonte de alimentação DC	Tenma	72-420	Usado para gravar eletricamente os pinos de dissecação
Digitalizador de eletrofisiologia	Instrumentos de axônio, dispositivos moleculares	Axônio DigiData 1440A	Permite a aquisição de dados de patch-clamp
filamento	Companhia de Instrumentos Sutter	FB255B	Filamento de caixa de 2,5 mm usado no extrator de micropipeta
Pinça fina	Ferramentas de Belas Ciências	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Artigo nº 11295-10	Usado para manipular larvas e inserir pinos
Microscópio DIC de platina fixa	Olimpo	BX51WI	Microscópio usado para visualizar e estabelecer gravações de patch-clamp
Ponteira de pipeta flexível e cônica	Fisher Científico	02-707-169	As pontas flexíveis permitem a inserção no eletrodo de registro para dispensar a solução extracelular na ponta
Prato de flúor	Instrumentos de precisão mundial Inc.	Rolamento FD3510-100	Prato de gravação com fundo de vidro de cobertura
KimWipe	KimTech	Rolamento 34155	Limpeza de tarefas usada para absorver o excesso de líquido das larvas
Kwik-Gard	Instrumentos de precisão mundial Inc.	710172	Elastômero sylgard auto-misturado
Amplificador de microeletrodo	Instrumentos de axônio, dispositivos moleculares	MultiClamp 700B	Amplificador de grampo de remendo para gravações de canal duplo
Microforja	Narishige	Microforja MF-830	Para polir o eletrodo de gravação
Unidade de controle do micromanipulador	Siskiyou	MC1000-eR/T	Coordenador de relógio comparador de 4 eixos para controle de micromanipulador
Extrator de micropipetas	Companhia de Instrumentos Sutter	Flamejante/Marrom P-97	Para puxar o vidro capilar em eletrodos de gravação
Unidade de controle para microscópio	Siskiyou	MC1000e	Posiciona o microscópio em torno da platina fixa e preparação
Micromanipulador motorizado	Siskiyou	MX7600	Posiciona o cabeçote e o eletrodo de gravação conectado para gravação de patch clamp
Comandante MultiClamp	Dispositivos Moleculares	2.2.2	Pode ser baixado da página de download do Axon MultiClamp 700B Commander
Mesa de ar óptica	Corporação Newport	VH3036W-OPT	Mesa de isolamento de placa de ensaio para microscópio flutuante e minimizar vibrações durante as gravações
GRAMPO	Dispositivos Moleculares	10.7.0	Pode ser baixado da página de download do software de aquisição e análise de dados de eletrofisiologia Axon pCLAMP 10
Placa de Petri	falcão	35-3001	Usado para imergir larvas em paralíticos
Porta-pipetas	Dispositivos Moleculares	1-HL-U	Segure o eletrodo de gravação e conecte-o ao headstage
Transdutor pneumático	Instrumentos biomédicos Fluke	DPM1B	Para controlar a pressão interna do eletrodo de registro
Hidróxido de potássio	Sigma-Aldrich	221473-25G	Condicionamento para gravação de pinos de dissecação
Tubos de silicone	Tygon	14-169-1A	Tubulação para conectar o transdutor pneumático ao suporte da pipeta
Estereomicroscópio	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Usado para visualizar pontas de pinos e durante a preparação de larvas
Lâmina de barbear de borda reta	Canopus	Encomende de amazon.com	Corta o fio de tungstênio enquanto faz pinos de dissecação
seringa	Becton Dickinson Compoany	309602	Preenchido com solução extracelular para injetar em eletrodos de gravação
Pipeta de transferência	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Pipeta não estéril de uso único para transferência de larvas
Metanossulfonato de tricaína	Syndel	12854	Farmacêutico anestésico usado para eutanasiar larvas com alta dosagem.
Fio de tungstênio	Instrumentos de precisão mundial Inc.	Rolamento 715500	0,002 polegadas, 50,8 μm de diâmetro; usado para fazer pinos de dissecação
Unidade de filtragem a vácuo	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Unidades de filtração a vácuo, estéreis e de uso único, usadas para esterilizar solução extracelular usada para campainha de eletrodo de eletrofisiologia
Tensão-pinça corrente-pinça headstage	Dispositivos Moleculares	CV-7B	Fornecido com o amplificador MultiClamp 700B usado como headstages esquerdo e direito
α-bungarotoxina	ThermoFisher	B1601	Para imobilizar as larvas antes do registro