Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Resumo

Fonte: Lunsford, E. T., et al. Atividade dos neurônios aferentes da linha lateral posterior durante a natação em peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra paralisada, posicionando uma micropipeta perto do gânglio da linha lateral e formando uma vedação solta para captura de sinal. A solução extracelular mantém a viabilidade neuronal durante esse processo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de materiais para registros eletrofisiológicos

1. Faça um prato de gravação com fundo de elastômero de silicone.
   1. Dispense uma fina camada de componentes de elastômero de silicone auto-misturados (por exemplo, Sylgard) em uma placa de cultura de tecidos com fundo de vidro de cobertura até que fique nivelada com a borda de um poço raso. Aproximadamente 0,5 mL é suficiente.
   2. Cubra e catalise o prato por no mínimo 48 h em temperatura ambiente.
2. Faça pinos de dissecação.
   1. Usando uma fonte de alimentação CC, forneça uma carga negativa (5 V) a um béquer de 100 mL de corrosão (3M KOH) e conecte um fio de tungstênio (0,002 polegadas; 50,8 μm de diâmetro) à saída carregada positivamente.
      cuidado: Os fios negativo e positivo não devem entrar em contato um com o outro durante este procedimento, pois você pode correr o risco de produzir faíscas, o que pode representar um risco potencial de incêndio.
   2. Grave o fio de tungstênio mergulhando rápida e repetidamente a ponta no banho de corrosão até que a ponta se estreite em uma ponta afiada. Sob um estereomicroscópio, corte o fio a aproximadamente 1 mm da ponta com uma lâmina de barbear de ponta reta. Repita mais três vezes e, em seguida, insira os pinos no prato de gravação curado usando uma pinça fina.
3. Prepare eletrodos de gravação.
   1. Usando um extrator de micropipeta horizontal com filamento de caixa, puxe um tubo capilar de vidro borossilicato (diâmetro interno: 0,86 mm, diâmetro externo: 1,50 mm) em eletrodos com ponta de 30 μm de diâmetro com leve conicidade (Figura 1 Ai) que será usado para registrar neurônios aferentes da linha lateral posterior.
   2. Puxe um tubo capilar de vidro borossilicato adicional em um par de eletrodos com diâmetros de ponta menores (1-5 μm). Segurando um eletrodo em cada mão, passe suavemente as pontas uma sobre a outra para quebrá-las em um ângulo de ~ 30 °. Usando uma microforja, polir a ponta chanfrada até ficar homogêneo.
4. Gerar o protocolo em programas de registro de eletrofisiologia.
   1. Certifique-se de que o cabeçote direito stage esteja conectado à entrada do Canal 1 na parte traseira da corrente do microeletrodo e voltage clamp amplifier para as gravações de neurônios aferentes.
      NOTA: As especificações do computador para o amplificador de pinça de corrente e tensão requerem minimamente um processador de 1 Ghz ou superior, Windows XP Pro ou Mac OS X 10.46.6, uma unidade de CD-ROM com 512 MB de RAM, 500 MB de espaço no disco rígido e 2 portas USB.
   2. Abra o software do amplificador controlado por computador.
   3. Defina o Canal 1 para o modo de grampo de corrente clicando no botão IC.
   4. Insira o seguinte parâmetro na guia I-Clamp 1. Saída primária: 100x potencial de membrana CA (100.000 mV/mV), ganho: 1.000, Bessel: 1 kHz, CA: 300 Hz, osciloscópio: bypass. Saída secundária: 100x potencial de membrana CA (100 mV/mV), ganho: 1, filtro passa-baixa: 10 Hz.
   5. Salve o parâmetro de canal como Ch1_Aff.
   6. Instale e abra o patch clamp software de eletrofisiologia
   .
   7. Clique em Configurar e selecione Lab Bench para configurar os sinais analógicos adicionando Ch1_Aff aos canais digitalizadores (por exemplo, Analog IN #0 e Analog IN #1) conectados por cabo coaxial BNC às saídas escalonadas do canal 1 correspondentes do amplificador. Clique em OK.
      NOTA: Os requisitos mínimos do computador para o digitalizador são: um processador de 1 Ghz ou superior, Windows XP Pro ou Mac OS X 10.46.6, unidade de CD-ROM de 512 MB de RAM, 500 MB de espaço no disco rígido e 2 portas USB.
   8. Clique em Adquirir e selecione Novo Protocolo.
   9. Na guia Modo/Taxa, selecione Livre de lacunas; em Modo de aquisição, defina Duração da avaliação como Usar espaço em disco disponível (ou seja, gravar até parar) ou uma Duração definida desejada (hh:mm:ss) e, em seguida, defina a Taxa de amostragem por sinal (Hz) como 20.000 para maximizar a resolução.
   10. Na guia Entradas, selecione os canais analógicos de entrada que foram configurados anteriormente (na etapa 1.4.6) e selecione Ch1_Aff para o canal correspondente.
   11. Na guia Saídas, selecione Cmd 0 e Cmd 1 para o Canal #0 e o Canal #1, respectivamente.
       1. Conecte o Comando do Canal 1 no amplifier para Saída Analógica 0 no digitalizador via cabo coaxial BNC.
   12. As guias restantes podem permanecer nas configurações padrão. Clique em OK e salve o protocolo.

2. Preparação da solução

1. Prepare a solução de Hank: 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO₄, 0,44 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄, 4,2 mM NaHCO₄; pH 7,3. Dilua a 10% da solução de Hank adicionando o volume apropriado de água deionizada ao caldo.
2. Prepare a solução extracelular: NaCl 134 mM, KCl 2,9 mM, MgCl₂ 1,2 mM, CaCl_2,1 mM 2, glicose 10 mM e tampão HEPES 10 mM, pH 7,8 ajustado com NaOH. Filtre a solução extracelular a vácuo através de um filtro com poros de 0,22 μm.
3. Prepare α -bungarotoxina: Dissolva 1 mg de α-bungarotoxina liofilizada em 10 mL de solução extracelular para produzir diluição de 0,1%.
4. Prepare a solução de eutanásia: 50% (mg/L) de MS-222 tamponado de grau farmacêutico em solução de Hank a 10%.
   CUIDADO: α-bungarotoxina é uma neurotoxina potente que paralisa os músculos bloqueando os receptores colinérgicos. Luvas são necessárias e proteção para os olhos é recomendada durante o manuseio do paralítico.

3. Preparação de larvas para registros eletrofisiológicos

1. Imobilize as larvas do peixe-zebra.
   1. Use larvas da população de peixe-zebra (Danio rerio; 4-7 dias após a fertilização) e aloje em solução embrionária (solução de Hank a 10%) a 27 ° C.
   2. Usando uma pipeta de transferência de ponta grande, transfira a larva do alojamento para uma pequena placa de Petri (35 mm) e remova o máximo possível da solução circundante.
      nota: A remoção da solução embrionária evita a diluição do paralítico e aumenta sua eficácia. O canto de uma limpeza de tarefas pode ser usado para absorver a solução embrionária restante, e é fundamental não entrar em contato com as larvas ou deixá-las expostas ao ar.
   3. Mergulhe as larvas em 10 μL de α-bungarotoxina a 0,1% por aproximadamente 5 min.
      nota: O tempo necessário para imobilizar as larvas varia entre as preparações. Uma preparação saudável depende do monitoramento rigoroso do fluxo sanguíneo rápido e sustentado e da diminuição das respostas motoras. A breve superexposição ao paralítico pode levar a um declínio lento na saúde geral da preparação, mesmo após uma lavagem completa. É melhor aplicar uma lavagem antes que a larva esteja completamente imobilizada, enquanto ainda mostra sinais de vibrações musculares sutis.
   4. Lave a larva paralisada com a solução extracelular e tome banho por 10 min.
      nota: A lavagem permite que a larva faça a transição de vibrações musculares sutis para paralisia completa. Além disso, a α-bungarotoxina é um antagonista da subunidade α9 do receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), que é um componente crítico do circuito de feedback endógeno que este protocolo observa; no entanto, esse efeito demonstrou ser reversível em células ciliadas de Xenopus e peixe-zebra após uma lavagem de 10 minutos.
2. Fixe peixes no prato de gravação.
   nota: A anestesia (por exemplo, MS-222, Tricaine) não é necessária durante a preparação de larvas de peixe-zebra (4-7 dpf), pois interfere na saúde animal. Na verdade, as larvas de peixe-zebra estão isentas de certos protocolos de vertebrados.
   1. Usando uma pipeta de transferência, mova a larva do banho de solução extracelular para o prato de gravação com fundo de silicone. Encha o restante do prato com a solução extracelular.
   2. Sob um estereomicroscópio, posicione suavemente as larvas com pinças de ponta fina acima do centro do tapete de silicone, com o lado lateral para cima, com as extremidades anterior e posterior do corpo correndo da esquerda para a direita, respectivamente. Em seguida, segure um pino gravado do tapete de silicone usando uma pinça de ponta fina e insira o pino, ortogonalmente ao silicone, através da notocorda dorsal das larvas diretamente dorsal ao ânus. Insira o segundo pino através da notocorda perto do final da cauda e insira o terceiro pino através da notocorda dorsal da bexiga gasosa (Figura 1B).
      nota: Ao inserir pinos, é importante atingir o centro da largura da notocorda para evitar afetar o fluxo sanguíneo ou danificar a musculatura circundante. A notocorda é dorsal ao nervo da linha lateral posterior, portanto, com a fixação adequada, nenhum dano é esperado aos neurônios sensoriais da linha lateral. Insira após o primeiro contato para não perturbar o tecido circundante. Idealmente, o diâmetro do pino é menor que a metade da largura da notocorda para garantir uma inserção limpa. Se os pinos excederem essa largura, repita a etapa 1.2 até que a largura desejada do pino seja atingida. Se o fluxo sanguíneo diminuir após a fixação, repita a partir do passo 1.3 com uma nova amostra.
   3. Insira o quarto pino através da vesícula ótica enquanto fornece uma leve rotação em direção à anterior à medida que o pino se insere no encapsulante (Figura 1B). À medida que uma ligeira rotação é aplicada, observe o tecido entre o cleitro e a vesícula ótica para revelar o aglomerado de somas aferentes.
      nota: A inserção angulada do quarto pino é para garantir a exposição do gânglio aferente da linha lateral posterior, que é obstruído pela grande vesícula ótica.

4. Registro de neurônios aferentes

1. Encha o eletrodo de registro aferente com 30 μL da solução extracelular, insira-o no suporte de pipeta de estágio de cabeça direita (Figura 1B, C) e abaixe-o na solução de prato enquanto aplica pressão positiva (1-2 mm Hg) produzida por um transdutor pneumático.
2. Localize e fixe-se frouxamente ao gânglio aferente da linha lateral posterior.
   1. Usando um micromanipulador, abaixe a ponta do eletrodo aferente até que ela esteja mantendo a posição acima do cleitrum
   2. Aumente a ampliação para imersão de 40x e localize a interseção do nervo da linha lateral posterior e do cleitrho. Siga o nervo da linha lateral anterior do cleitro até onde as fibras inervam o gânglio aferente da linha lateral posterior, distinguível pelo discreto aglomerado de soma (Figura 1F).
   3. Traga a ponta do eletrodo sobre o gânglio aferente e abaixe a pipeta até que a ponta entre em contato com o epitélio. Suavemente, manobre o eletrodo para que toda a circunferência da ponta entre em contato com o gânglio aferente.
   4. Aplique pressão negativa (20-50 mm Hg) com o transdutor pneumático e segure.
      nota: A pressão negativa aplicada ao gânglio aferente é suave. O aumento da pressão negativa pode melhorar a relação sinal-ruído, mas a saúde dos neurônios aferentes diminui sob sucção agressiva sustentada, o que diminui a probabilidade de uma gravação bem-sucedida.
3. Registre a atividade dos neurônios aferentes.
   1. O estágio da cabeça esquerda deve ser conectado ao amplificador, que retransmite o sinal amplificado em um digitalizador que emite o referido sinal no software de eletrofisiologia do patch clamp para ser monitorado em um computador adjacente.
   2. No pClamp10, clique no botão Reproduzir na barra de ferramentas para monitorar os neurônios aferentes.
   3. Certifique-se de que toda a célula, o registro de manchas soltas de neurônios aferentes seja alcançado assim que os picos ocorrerem espontaneamente, aproximadamente a cada 100-200 ms (Figura 1E).
   4. Gradualmente, aumente a pressão do eletrodo de registro de neurônios aferentes de volta à atmosférica (0 mm Hg) e segure pelo restante da gravação.

Resultados

Figura 1: Registro eletrofisiológico simultâneo do neurônio aferente da linha lateral posterior e da atividade da raiz motora ventral. (A). Exemplo de eletrodos de registro de aferente (i) e raiz motora ventral (ii) de mancha solta. As barras de escala representam 50 μm. (B) As larvas de peixe-zebra são paralisadas e fixadas em quatr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Copo de 100 mL	Pyrex	1000	Receptáculo para engrenagem
Objetiva de imersão em água 10x	Olimpo	UMPLFLN10xW	Baixa ampliação para posicionamento de larvas e eletrodo de registro
Objetiva de imersão em água 40x	Olimpo	LUMPLFLN40XW	Maior ampliação para posicionar a ponta do eletrodo e estabelecer o patch-clamp
Cabos coaxiais BNC	ThorLabs	2249-C-12	Conectando canais de amplificador e digitalizador; requer 4
Capilares de vidro borossilicato c/ filamento	Warner Instruments	G150F-3	Diâmetro interno: 0,86, diâmetro externo: 1,50; vidro capilar usado para formar eletrodos de gravação
computador	N/A	N/A	Qualquer computador deve funcionar
Fonte de alimentação DC	Tenma	72-420	Usado para gravar eletricamente os pinos de dissecação
Digitalizador de eletrofisiologia	Instrumentos de axônio, dispositivos moleculares	Axônio DigiData 1440A	Permite a aquisição de dados de patch-clamp
filamento	Companhia de Instrumentos Sutter	FB255B	Filamento de caixa de 2,5 mm usado no extrator de micropipeta
Pinça fina	Ferramentas de Belas Ciências	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Artigo nº 11295-10	Usado para manipular larvas e inserir pinos
Microscópio DIC de platina fixa	Olimpo	BX51WI	Microscópio usado para visualizar e estabelecer gravações de patch-clamp
Ponteira de pipeta flexível e cônica	Fisher Científico	02-707-169	As pontas flexíveis permitem a inserção no eletrodo de registro para dispensar a solução extracelular na ponta
Prato de flúor	Instrumentos de precisão mundial Inc.	Rolamento FD3510-100	Prato de gravação com fundo de vidro de cobertura
KimWipe	KimTech	Rolamento 34155	Limpeza de tarefas usada para absorver o excesso de líquido das larvas
Kwik-Gard	Instrumentos de precisão mundial Inc.	710172	Elastômero sylgard auto-misturado
Amplificador de microeletrodo	Instrumentos de axônio, dispositivos moleculares	MultiClamp 700B	Amplificador de grampo de remendo para gravações de canal duplo
Microforja	Narishige	Microforja MF-830	Para polir o eletrodo de gravação
Unidade de controle do micromanipulador	Siskiyou	MC1000-eR/T	Coordenador de relógio comparador de 4 eixos para controle de micromanipulador
Extrator de micropipetas	Companhia de Instrumentos Sutter	Flamejante/Marrom P-97	Para puxar o vidro capilar em eletrodos de gravação
Unidade de controle para microscópio	Siskiyou	MC1000e	Posiciona o microscópio em torno da platina fixa e preparação
Micromanipulador motorizado	Siskiyou	MX7600	Posiciona o cabeçote e o eletrodo de gravação conectado para gravação de patch clamp
Comandante MultiClamp	Dispositivos Moleculares	2.2.2	Pode ser baixado da página de download do Axon MultiClamp 700B Commander
Mesa de ar óptica	Corporação Newport	VH3036W-OPT	Mesa de isolamento de placa de ensaio para microscópio flutuante e minimizar vibrações durante as gravações
GRAMPO	Dispositivos Moleculares	10.7.0	Pode ser baixado da página de download do software de aquisição e análise de dados de eletrofisiologia Axon pCLAMP 10
Placa de Petri	falcão	35-3001	Usado para imergir larvas em paralíticos
Porta-pipetas	Dispositivos Moleculares	1-HL-U	Segure o eletrodo de gravação e conecte-o ao headstage
Transdutor pneumático	Instrumentos biomédicos Fluke	DPM1B	Para controlar a pressão interna do eletrodo de registro
Hidróxido de potássio	Sigma-Aldrich	221473-25G	Condicionamento para gravação de pinos de dissecação
Tubos de silicone	Tygon	14-169-1A	Tubulação para conectar o transdutor pneumático ao suporte da pipeta
Estereomicroscópio	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Usado para visualizar pontas de pinos e durante a preparação de larvas
Lâmina de barbear de borda reta	Canopus	Encomende de amazon.com	Corta o fio de tungstênio enquanto faz pinos de dissecação
seringa	Becton Dickinson Compoany	309602	Preenchido com solução extracelular para injetar em eletrodos de gravação
Pipeta de transferência	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Pipeta não estéril de uso único para transferência de larvas
Metanossulfonato de tricaína	Syndel	12854	Farmacêutico anestésico usado para eutanasiar larvas com alta dosagem.
Fio de tungstênio	Instrumentos de precisão mundial Inc.	Rolamento 715500	0,002 polegadas, 50,8 μm de diâmetro; usado para fazer pinos de dissecação
Unidade de filtragem a vácuo	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Unidades de filtração a vácuo, estéreis e de uso único, usadas para esterilizar solução extracelular usada para campainha de eletrodo de eletrofisiologia
Tensão-pinça corrente-pinça headstage	Dispositivos Moleculares	CV-7B	Fornecido com o amplificador MultiClamp 700B usado como headstages esquerdo e direito
α-bungarotoxina	ThermoFisher	B1601	Para imobilizar as larvas antes do registro