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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de fatias agudas do cérebro do hipocampo
- Preparação de soluções de fatias
- Prepare 500 mL de solução de corte de sacarose composta por: 194 mM de sacarose, 30 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 10 mM de D-glicose, 1 mM de MgCl2, 1,2 mM de NaH2PO4 e 26 mM de NaHCO3, 290-300 mOsm, saturados com 95% de O2 e 5% de CO2.
- Prepare 1-2 litros de solução de registro (líquido cefalorraquidiano artificial, ACSF) composta por: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glicose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4 e 26 mM NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 (após borbulhar), 290 - 300 mOsm, saturado com 95% de O2 e 5% de CO2. Encher um copo contendo uma câmara porta-fatias de cérebro com solução de registo e mantê-lo a 32-34 °C. Encher a câmara do vibratomo com lama de água gelada.
- Preparação de fatias agudas
- Anestesie profundamente um camundongo colocando-o em uma campânula pré-carregada com 2-3 mL de isoflurano. Verifique o reflexo de pinça do dedo do pé e, se não responder, decapite-o rapidamente usando uma tesoura afiada ou guilhotina, conforme exigido pelo protocolo do animal.
- Faça uma incisão de 2-3 cm usando uma tesoura da porção caudal do crânio para cortar o couro cabeludo ao longo da linha média. Enquanto retrai manualmente o couro cabeludo, faça duas incisões horizontais de 1 cm do forame magno ao longo dos lados do crânio. Em seguida, usando uma tesoura fina, faça uma incisão no comprimento do crânio, ao longo da linha média da parte de trás do crânio até o nariz.
- Usando uma pinça fina inserida perto da linha média, retraia o crânio inciso em duas porções. Extraia o cérebro do camundongo do crânio e use uma lâmina para remover o cerebelo e os bulbos olfatórios, que estão localizados respectivamente nas porções caudal e rostral do cérebro. Estes podem ser identificados pelas grandes fissuras, que os separam do córtex.
- Monte o bloco cerebral na bandeja de vibratomo usando super cola. Encha a bandeja do vibratomo com solução de corte a frio.
- Corte seções de tecido no plano coronal com 300 μm de espessura. Normalmente, 6 fatias coronais do hipocampo podem ser coletadas.
- Depois de cada seção ser cortada, transfira imediatamente as fatias para o copo de retenção de fatias aquecido a 32-34 ° C. Mantenha as seções nessa temperatura por 20 minutos antes de remover o béquer que contém as seções e coloque-o em temperatura ambiente por pelo menos 20-30 minutos antes da gravação.
2. Medição da Dinâmica de K+ Evocado Eletricamente
- Configurando a preparação da fatia
- Coloque delicadamente a fatia de cérebro na banheira usando uma pipeta Pasteur e segure-a suavemente no lugar com uma harpa de platina com cordas de náilon.
- Certifique-se de que as pontas do eletrodo estimulante bipolar estejam paralelas umas às outras e niveladas com o plano da fatia. Lentamente, ao longo de 6-7 segundos, insira os eletrodos no estrato radiato CA3 com aproximadamente 40-50 μm de profundidade para estimular as colaterais de Schaffer. Em cortes coronais, CA3 pode ser aproximadamente identificado como a porção do hipocampo lateral adequada à camada de células granulares no gênero hipocampal, com o estrato radiado caindo medial e ventral à camada de células piramidais.
- Insira cuidadosamente o eletrodo seletivo de K+ no estrato radiado CA1 com aproximadamente 50 μm de profundidade, abaixando lentamente o eletrodo por aproximadamente 3-4 segundos. Permita que o potencial se estabilize no eletrodo antes de aplicar estímulos à fatia: isso geralmente leva de 5 a 10 minutos. Se a fatia apresentar alterações espontâneas no K+ extracelular, descarte e repita esse processo com uma nova fatia.
- Medir a liberação de K+ evocada
- Aplique trens de estimulação elétrica (8 pulsos) pressionando manualmente o gatilho no estimulador enquanto registra digitalmente as respostas. Aplique estimulação a 10 Hz e largura de pulso de 1 ms, começando na amplitude do estímulo de 10 μA.
- Aplique amplitudes de estimulação crescentes por um fator de 2 até que uma amplitude máxima de resposta K+ seja detectada. Se você não observar nenhuma resposta, mova a posição do eletrodo K+ para mais perto do local de estimulação em 100 μm em incrementos
- Determine a amplitude do estímulo que produz a resposta máxima pela metade. Em nossa experiência, isso está entre 40-160 μA, dependendo da qualidade do preparo, da idade do animal e da distância entre os eletrodos de estimulação e o eletrodo seletivo de K+.
- Na mesma fatia, usando uma amplitude de estímulo em um passo abaixo da amplitude que produz a resposta semimáxima (por exemplo, se 80 μA produz uma resposta semimáxima, use 40 μA) aplique trens de estímulo de número crescente de pulsos. Inicialmente, usamos trens de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 e 128 pulsos.
- Para confirmar que os sinais de K+ são mediados pelo disparo do potencial de ação do banho colateral de Schaffer eletricamente estimulado, aplique 0,5 μM de tetrodotoxina (TTX) em ACSF por 10 minutos e repita o protocolo de estimulação. Nenhuma resposta evocada deve ser observada.
- Depois de terminar o experimento de fatia, confirme se o eletrodo manteve sua responsividade recalibrando o eletrodo nas soluções de calibração e garantindo que a resposta não se desviou em mais de 10% da calibração inicial