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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
NOTA: As gravações de Q175 de tipo selvagem (WT) e heterozigotos (HETs) podem ser realizadas em qualquer idade e sexo. Aqui estudamos homens e mulheres com idade entre 51 e 76 semanas.
1. Injeção do Sensor de Glutamato iGluu para Expressão em Axônios Corticoestriatais
- Use o extrator de pipetas (modo de uma etapa) para preparar pipetas de vidro borossilicato para a injeção do vírus. Depois de puxar, quebre a pipeta manualmente para obter um diâmetro de ponta de 30 a 50 μm. Autoclave a pipeta e os instrumentos cirúrgicos, incluindo a broca para abertura do crânio.
- Armazene o vírus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) a -80 °C em alíquotas de 10 μL. Se as injeções forem realizadas logo após a produção do vírus (dentro de 6 meses), mantenha a 5 °C. Antes da cirurgia, retire o frasco para injetáveis e mantenha-o à temperatura ambiente.
- Encha a pipeta de vidro e remova as bolhas.
- Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de uma solução contendo 87,5 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina. Injete subcutaneamente bupivacaína a 0,25% (8 mg/kg) para alívio adicional da dor. Verifique a profundidade da anestesia monitorando o tônus muscular e observando a ausência de reflexos induzidos pela dor.
- Raspe a pele da cabeça e esterilize-a com álcool 70%. Encaixe o mouse no quadro estereotáxico.
- Use um bisturi para remover a pele e uma broca de alta velocidade (38.000 rpm) para fazer um orifício de 1,2 mm no osso acima do córtex motor.
- Monte a seringa com a pipeta de injeção acoplada no suporte de um manipulador de precisão. Insira a pipeta orientada verticalmente no córtex em 4 locais diferentes. As coordenadas de injeção são, em relação ao bregma (em mm): anterior 1,5, lateral 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. A profundidade em relação à dura-máter é (em mm): 1,5–1,7.
- Usando o sistema de injeção, injete 0,3 μL por local da solução viral não diluída com uma velocidade de 0,05 μL / min. Após cada injeção, deixe a pipeta no lugar durante 1 minuto antes de a retirar lentamente (1 mm/min).
- Termine fechando a ferida cirúrgica com uma sutura de náilon.
- Deixe o mouse por 0,5 a 1 h em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa antes de devolvê-lo à sua gaiola original.
- Mantenha o camundongo em um ciclo dia-noite de 12 h por 6 a 8 semanas antes da preparação de fatias agudas de cérebro.
nota: Para evitar reações imunes que resultem em dano celular e perda de sinapse, a injeção de múltiplas construções virais deve ser realizada simultaneamente ou dentro de 2 a 3 horas após a injeção primária. As coordenadas para a injeção de iGluu foram selecionadas de acordo com o atlas cerebral de Paxinos e Franklin. Eles correspondem ao córtex motor M1. A imunocoloração de cérebros injetados visualizou numerosos axônios e varicosidades de axônios bem isolados no estriado ipsi e contralateral e nos córtices M1 e S1 contralaterais.
2. Procure por terminais glutamatérgicos que expressam o sensor de glutamato iGluu
- Modo de calibração
- Prepare a câmera sCMOS e o software de controle da câmera com as seguintes configurações. Na página Leitura, defina Taxa de leitura de pixels: 560 MHz (= leitura mais rápida), Sensibilidade/Faixa dinâmica: bits, Filtro de ruído espúrio: Sim, Leitura de sobreposição: Sim. Na página Binning/ROI, selecione Tela inteira.
- Prepare uma lâmina de vidro contendo uma gota de 5 mg / mL de Amarelo de Lúcifer (LY) sob uma lamínula.
- Coloque o slide LY sob uma objetiva de 63x, abra o obturador do laser e execute uma aquisição serial usando as seguintes configurações: Pixel Binning: 1x1, Modo de disparo: Interno, Tempo de exposição: Mínimo (a ser determinado).
- Ajuste a potência do laser para produzir um ponto de fluorescência de 4 μm de diâmetro (a imagem não deve conter pixels saturados).
- Para realizar uma calibração do sistema de posicionamento a laser, selecione as seguintes configurações no software de posicionamento a laser: Diâmetro do tamanho do ponto: 10, Velocidade de varredura: 43.200 kHz. Clique no botão Iniciar aquisição de imagem no painel direito. Defina Execuções: 0, Atraso de execução: 0 e selecione a opção Executar em TTL na página Sequência. Clique no botão Calibrar na página Calibração e calibre o software de controle do laser de acordo com as instruções mostradas no canto superior esquerdo da tela de aquisição.
- Se a configuração usar software independente para controle de câmera e laser, adquira capturas de tela da janela de aquisição da câmera e envie-as ao software de controle a laser para um recálculo das coordenadas XY. Se o software estiver instalado em computadores diferentes, use um capturador de vídeo para importar a imagem para o software de controle a laser. O software de controle a laser precisará das informações sobre os fatores de escala e deslocamentos XY. Para isso, determine as coordenadas dos cantos superior esquerdo, inferior esquerdo e inferior direito da imagem dentro da janela de aquisição do programa de controle do laser. Calcule os fatores de escala de acordo com as seguintes equações: Fator X = (X inferior direito – X inferior esquerdo)/2048, Deslocamento X = X inferior esquerdo, Fator Y = (Y superior esquerdo – Y inferior esquerdo)/2048, Deslocamento Y = Y inferior esquerdo.
- No final do procedimento de calibração, crie uma região retangular de interesse (ROI) de 267x460 pixels, mova-a para o centro da tela e clique no botão Iniciar sequência.
- Volte para as seguintes configurações do software de controle da câmera: Binning: 2x2, Modo de disparo: Exposição externa, Tempo de exposição: Mínimo (a ser determinado).
- Modo de correção de autofluorescência
NOTA: O nível de repouso de [Glu] no ambiente de terminais sinápticos ativos é normalmente inferior a 100 nM. Assim, qualquer sensor de glutamato, especialmente um sensor de baixa afinidade como o iGluu, será bastante fraco na ausência de liberação sináptica de glutamato. No entanto, alguma fluorescência do iGluu pode até ser detectada em repouso, mas deve ser distinguida da autofluorescência do tecido. A iluminação de 473 nm provoca fluorescência e autofluorescência iGluu (Figura 1A-C). Este último ocupa uma ampla gama de comprimentos de onda, enquanto a fluorescência iGluu é limitada a 480–580 nm (com um máximo de 510 nm). A correção para autofluorescência é baseada na aquisição de duas imagens com diferentes filtros passa-altas.
- Prepare fatias de cérebro com antecedência, conforme descrito em outro lugar. Mantenha as fatias de farelo prontas.
- Transfira as fatias para a câmara de registro, submergindo-as em fluido cefalorraquidiano artificial oxigenado (ACSF) contendo 125 mM de cloreto de sódio (NaCl), 3 mM de cloreto de potássio (KCl), 1,25 mM de di-hidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4), 25 mM de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 2 mM de cloreto de cálcio (CaCl2), 1 mM de cloreto de magnésio (MgCl2), glicose 10 mM (pH 7,3, 303 mOsm/L), suplementada com piruvato de sódio 0,5 mM, ascorbato de sódio 2,8 mM e glutationa 0,005 mM. Use uma taxa de fluxo de 1–2 mL/min. Mantenha a temperatura do banho em 28–30 °C.
- Localize o estriado dorsal sob uma objetiva de imersão em água de 20x. Fixe as fatias com uma grade de náilon em uma harpa de platina para minimizar o movimento do tecido. Mude para a objetiva de imersão em água 63x /NA 1.0. Selecione filtros que reflitam a luz a 473 nm (espelho dicróico) e a luz que passa com comprimentos de onda >510 nm (filtro de emissão).
- Sincronize a iluminação, estimulação e aquisição de imagem usando uma placa analógico-digital (AD)/digital-analógico (DA) (AD/DA) com o respectivo software de controle. Defina o programa de disparo para controlar a aquisição com um tempo de exposição do laser de 180 ms e um tempo de aquisição de imagem de 160 ms. Use o dispositivo de posicionamento a laser para enviar o feixe de laser para um número predeterminado de pontos e defina as configurações para Velocidade de varredura e Tamanho do ponto.
- Adquira uma imagem de autofluorescência e estruturasiGlu u-positivas usando um filtro passa-alta a 510 nm ("imagem amarela").
- Adquira uma imagem apenas com autofluorescência usando um filtro passa-alta a 600 nm ("imagem vermelha").
- Dimensione as imagens vermelhas e amarelas, usando as intensidades médias dos 10 pixels mais claros e dos 10 mais escuros para definir o intervalo. Execute uma subtração "imagem amarela menos vermelha" e redimensione a imagem subtraída para gerar um arquivo tif padrão de 8 bits para visualização conveniente do botão de interesse (Figura 1D). Ele contém os pixels brilhantes das estruturasiGlu u-positivas, pixels cinza do fundo e pixels escuros de estruturas com autofluorescência.
nota: Com o equipamento fornecido, a fluorescência média em repouso (F) será inferior a 700 UA.
- Modo de pesquisa Bouton
NOTA: Os pixelsiGlu u-positivos podem pertencer a elementos funcionalmente diferentes da árvore axonal, como ramos axônicos de ordem diferente, locais de bifurcação, varicosidades após depleção de vesículas ou varizes totalmente ativas. No entanto, é quase impossível identificar terminais sinápticos funcionais apenas por inspeção visual. Portanto, cada terminal sináptico glutamatérgico precisa ser identificado por sua capacidade de resposta à despolarização elétrica. Os locais que não respondem à estimulação devem ser descartados. O meio fisiológico para induzir a liberação de glutamato dos axônios corticoestriados é eliciar um potencial de ação. Isso pode ser alcançado usando um canal de rodopsina de características espectrais apropriadas ou por estimulação elétrica de um axônio visualizado pelo próprio iGluu. Para evitar a ativação acidental da opsina, preferimos o último approastep
- Use o extrator de micropipetas (em um modo de quatro etapas) para produzir pipetas de estimulação a partir de capilares de vidro borossilicato. O diâmetro interno da ponta deve ser de cerca de 1 μm. Quando preenchido com ACSF, a resistência do eletrodo deve ser de cerca de 10 MΩ.
- Para induzir a liberação dependente do potencial de ação de glutamato de um conjunto de botões sinápticos ligados ao mesmo axônio, use a ampliação de 63x, o filtro de emissão de 510 nm e a imagem subtraída para colocar um eletrodo de estimulação de vidro próximo a uma varicosidade fluorescente. Evite a proximidade de axônios adicionais.
- Ligue o estimulador para fornecer pulsos de corrente despolarizante à pipeta de estimulação. Use intensidades de corrente em torno de 2 μA (não mais que 10 μA).
- Ligue o sistema de aplicação de banho multicanal, onde um canal fornece a solução de banho padrão e os outros canais fornecem os bloqueadores necessários de canais iônicos, transportadores ou receptores de membrana. Controle o fluxo no local de registro e, em seguida, mude para o canal de tetrodotoxina (TTX) (solução de banho mais 1 μM TTX). Após 2–3 min, estimule o botão de interesse novamente, mas agora na ausência de geração de potencial de ação. A liberação é diretamente devida ao influxo de cálcio através dos canais de cálcio dependentes da voltagem.
- Girando a tecla de intensidade no estimulador, ajuste a corrente de estimulação para obter respostas semelhantes às provocadas por meio de potenciais de ação. Normalmente, a corrente de estimulação seria de cerca de 6 μA para uma despolarização de 0,5 ms.
- Para testes básicos da preparação, aplique 0,5 mM CdCl2. A presença desse bloqueador dos canais de cálcio libera completamente a liberação de glutamato sináptico, validando assim a dependência de cálcio do sinal de glutamato evocado diretamente.
nota: A recomendação geral a seguir pode ajudar a aumentar a taxa de sucesso de experimentos de sinapse única no estriado. Para selecionar terminais sinápticos glutamatérgicos com maquinário de liberação intacto, uma varicosidade deve: (i) Ter uma forma fusiforme lisa; (ii) Não estar associado a uma bifurcação do axônio; (iii) Ser mais brilhante do que outras estruturas na "imagem amarela"; (iv) Residir no neurópilo estriatal e não nos tratos de fibras; (v) Residir em um ramo axônico muito fino; (vi) Não residir nas partes mais profundas da fatia.
3. Visualização da Liberação e Depuração de Glutamato
- Modo de gravação
NOTA: Após a subtração da autofluorescência (etapa 2.2) e alguns testes iniciais de capacidade de resposta do botão de interesse (Etapa 2.3), a aquisição de dados pode começar. As respostas à ativação elétrica da liberação de glutamato a partir de terminais de axônio único podem ser observadas diretamente na imagem (Figura 2), sem a aplicação de ferramentas de análise adicionais. No entanto, provou ser muito conveniente extrair imediatamente alguns indicadores básicos do desempenho da sinapse (Figura 3). Esta informação é necessária para tomar decisões sobre o curso subsequente da experiência, tais como a selecção de tipos terminais específicos, a avaliação rápida das alterações relacionadas com a DH, o número e a frequência dos ensaios ou fármacos a serem aplicados com o sistema de superfusão. Também pode ser necessário lidar com artefatos que eventualmente aparecem. Primeiro, as configurações padrão para gravação de dados são descritas.
- Usando as unidades XY do microscópio, coloque o botãoiGlu u-positivo testado próximo ao centro do viewcampo. Pare a aquisição de imagem com o botão Abortar aquisição. Na última imagem adquirida, determine a posição XY do centro do botão em repouso clicando nela com o botão esquerdo do mouse. As coordenadas XY do cursor definido serão mostradas no painel de status inferior da janela de aquisição.
- Usando os dados de calibração (etapa 2.1.6), calcule as coordenadas do local onde o feixe de laser deve ser enviado para a excitação da fluorescência iGluu. Use as seguintes equações: Laser X = Câmera X * Fator X + Deslocamento X, Laser Y = Deslocamento Y – Câmera Y * Fator Y. Ao realizar esse recálculo, preste atenção às configurações de inversão vertical ou horizontal da câmera.
- Crie uma sequência de um ponto no software de controle do laser usando as coordenadas calculadas. Para isso, selecione Ponto na caixa Adicionar à sequência na página Sequência do software de controle do laser. Selecione 10 μs para o atraso para acionar o início e 180 ms para o tempo de pulso do laser. Mova o mouse para as coordenadas calculadas e clique no botão esquerdo.
- Selecione as seguintes configurações no software de controle do laser: Execuções: 0, Atraso de execução: 0, Sequência: Executar em TTL. Em seguida, clique em Iniciar sequência.
- No software de controle da câmera, selecione as seguintes configurações: Na página Binning/ROI, defina Área da imagem: Personalizado, Pixel Binning: 2x2, Altura: 20, Largura: 20, Esquerda: Coordenada X do pontoiGlu u-positivo em repouso menos 10 px, Inferior: Coordenada Y do pontoiGlu u-positivo em repouso menos 10 px, Modo de aquisição: Série cinética, Comprimento da série cinética: 400, Tempo de exposição: 0,0003744s (valor mínimo). Com essas configurações, a taxa de aquisição será de 2,48 kHz.
- Selecione Modo de acionamento: Externo. Clique em Obter sinal no software de controle da câmera. Iniciar o protocolo experimental previsto para o dispositivo de disparo.
- Implementar o protocolo experimental Trial com a seguinte linha do tempo: 0 ms – iniciar teste, 1 ms – iniciar iluminação a laser, 20 ms – iniciar aquisição de imagem com câmera, 70 ms – iniciar estimulação elétrica 1, 120 – iniciar estimulação elétrica 2, 181 ms – final teste (laser e câmera desligados). Assim, durante um teste, a câmera adquire 400 quadros com uma frequência de 2,48 kHz. Consulte as etapas 2.3.3 e 2.3.5. para obter detalhes sobre estimulação elétrica.
- Para permitir a recuperação suficiente de pools de vesículas pré-sinápticas, aplique o protocolo Trial com uma frequência de repetição de 0,1 Hz ou inferior.
- Construção off-line do glutamato transitório e avaliação rápida da liberação e depuração do glutamato para a identificação de sinapses patológicas
- Ative as rotinas de avaliação. Aqui, usamos um software escrito internamente SynBout v. 3.2. (autor: Anton Dvorzhak). As etapas a seguir são necessárias para construir um transiente ΔF / F a partir dos pixels com fluorescência iGluu elevada, como no vídeo da Figura 2.
- Para determinar o tamanho do botão, calcule a média e o desvio padrão (DP) da intensidade de fluorescência da ROI em repouso (F), antes do início da estimulação. Determine e encaixote a área ocupada pelos pixels com F>média + 3 DP (Figura 3A). Determine um diâmetro virtual (em μm) assumindo uma forma circular da área supra-limiar.
- Determine ΔF como a diferença entre o valor da intensidade de pico e F. Represente graficamente a corrente de estimulação e ΔF/F em relação ao tempo (Figura 3B). Calcule o DP de ΔF/F em repouso (antes do início da estimulação) e a "amplitude de pico". Use pixel com amplitude de pico superior a 3 SD de ΔF/F para realizar o ajuste monoexponencial para o decaimento do pico. Determine a constante de tempo de decaimento TauD de ΔF/F.
- Para estimar a "Amplitude máxima" em uma determinada sinapse, selecione o pixel com o maior valor ΔF/F. Normalmente está localizado dentro ou próximo aos limites do botão de repouso iGluu fluorescência. A "amplitude máxima" seria o melhor indicador da carga de glutamato apresentada ao maquinário de depuração de uma única sinapse.
