Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Cirurgia
- Para registros eletrofisiológicos, use uretano (CUIDADO) para anestesia.
cuidado: O uretano é tóxico e cancerígeno, portanto, sempre siga as normas de segurança e a ficha técnica fornecida pelo fabricante da substância.
- Prepare uma solução de uretano 200 mg / mL em solução salina médica de cloreto de sódio (NaCl) a 0,9%.
- Administrar um total de 1,3 g/kg de peso corporal de uretano por via intraperitoneal (IP). Dependendo da cepa do rato, pode ser razoável dividir a dose em duas doses com um intervalo de 15 minutos entre as injeções, a fim de aumentar a segurança da anestesia.
- Verifique a profundidade da anestesia usando o reflexo de retirada do pedal e outros reflexos adequados. Se a anestesia não for profunda o suficiente para realizar a cirurgia, injete 0,15 g/kg de peso corporal de uretano IP e aguarde mais 15 min.
- Aplique uma pomada para os olhos para evitar a desidratação da córnea.
- Monitore constantemente a frequência respiratória e o reflexo de retirada do pedal durante a anestesia. Use uma almofada de aquecimento para pequenos animais com controle de temperatura para garantir que uma temperatura corporal fisiológica seja mantida durante toda a cirurgia. Antes de iniciar os registros eletrofisiológicos, mude para uma alternativa não elétrica (por exemplo, almofada de cabeça de acetato de sódio).
- Raspe o pelo ao longo do lado dorsal da cabeça para obter um campo cirúrgico limpo. Desinfete ao redor do local da incisão com desinfetante cirúrgico apropriado. Fixe o animal no quadro estereotáxico.
- Realize uma incisão de 2 cm de comprimento no couro cabeludo na direção sagital com um bisturi. Use um bisturi para raspar levemente a aponeurose do crânio e desinfetar o crânio. Use cotonetes embebidos em peróxido de hidrogênio a 3% (H2O2) para remover qualquer tecido restante.
- Use um eletrocauter ou termocauter para controlar o sangramento, se necessário. Pare os sangramentos do osso do crânio e da hipoderme, se o sangramento não parar espontaneamente após 1-2 minutos e dificultar a visão do crânio.
- Ajuste a barra incisiva até que a cabeça esteja posicionada na posição plana do crânio, o que significa que o bregma e o lambda como pontos de referência estereotáxicos estão no mesmo plano. Isso é muito importante para alcançar alta precisão cirúrgica. Use uma ferramenta de alinhamento de rato estereotáxico padrão, calibre a ponta designada para o bregma sob visão microscópica e ajuste a barra incisiva até que os pontos designados para o bregma e lambda na ferramenta toquem o crânio ao mesmo tempo.
nota: Uma visão de um lado com luz focada do outro pode ajudar a determinar essa condição. Alternativamente, pegue um suporte estereotáxico com uma cânula fina e meça as coordenadas dorsoventrais de Bregma e lambda sob visão microscópica. Ajuste a barra incisiva até que as coordenadas dorsoventrais de Bregma e lambda sejam as mesmas.
- Use um suporte estereotáxico com uma cânula, calibre para o bregma e, em seguida, calcule a posição de todos os furos no crânio. Usando o suporte estereotáxico, marque as posições dos orifícios a serem perfurados coçando cuidadosamente o crânio ou usando um marcador de cor cirúrgico. As coordenadas para isso dependem dos alvos; as coordenadas com referência ao bregma são fornecidas para a via hiperdireta na Tabela 1, incluindo as coordenadas sugeridas para os eletrodos de referência cerebelares.
- Usando uma micro broca, faça todos os furos com cuidado. Para o núcleo subtalâmico (STN) e a substância negra pars reticulada (SNr), faça um orifício comum (aproximadamente 2 mm x 3 mm de tamanho). Todos os outros furos devem ter um diâmetro de cerca de 1 mm.
- Pegue duas cânulas finas (pelo menos 27 G) e dobre suas pontas para formar uma forma de gancho, usando uma superfície dura ou uma pinça. Use-os para remover quaisquer detritos dos furos e corte e remova cuidadosamente a dura-máter no orifício STN/SNr comum.
- Lave os furos com solução salina fisiológica. Aplique uma gota de solução salina fisiológica a cada 15 minutos nos furos para evitar que o cérebro e a dura-máter sequem.
- Pegue uma microbroca e um microparafuso de aço inoxidável correspondente (por exemplo, um parafuso M 1.2 mm x 2 mm), faça um furo e aparafuse um microparafuso entre os furos dos eletrodos epidurais de referência acima do cerebelo, faça o mesmo para os eletrodos epidurais M1.
- Deslize os eletrodos epidurais Ag/AgCl autoconstruídos nos orifícios para os eletrodos de referência e eletrodos M1. Guie a ponta do eletrodo com uma pinça fina e deslize-a diretamente abaixo do osso do crânio para dentro do orifício
.
- Fixe todos os eletrodos epidurais com acrílico dental de dois componentes. Certifique-se de não cobrir o ponto de bregma nem afetar o orifício STN/SNr comum.
- Insira o suporte preparado com os eletrodos de microfios de tungstênio na estrutura estereotáxica.
- Calibre o eletrodo mais ventral, que se destina a atingir o STN, para o bregma. Ajuste para a posição calculada acima do orifício STN/SNr comum e abaixe os eletrodos até o cérebro sob visão microscópica. Certifique-se de que os eletrodos de microfios de tungstênio entrem no cérebro sem problemas.
2. Mapeamento e Gravações Eletrofisiológicas
NOTA: Para esta etapa, é necessária uma gaiola de Faraday e um sistema de registro eletrofisiológico multicanal com software de gravação capaz de filtragem online e classificação de pico online. De preferência, use um sistema que funcione com um pré-amplificador posicionado próximo à cabeça dos animais para manter o ruído elétrico e os artefatos no mínimo absoluto. Além dos eletrodos de microfios de tungstênio, pelo menos um eletrodo peridural e um eletrodo de referência são necessários para realizar o registro da via hiperdireta. Recomenda-se inserir eletrodos epidurais e de referência em pares sem que eles se toquem, isso ajuda em caso de mau funcionamento e permite diferentes tipos de referência na análise de dados.
- Coloque uma gaiola de Faraday móvel acima da estrutura estereotáxica. Se apenas uma gaiola de Faraday estacionária estiver disponível, mova cuidadosamente a estrutura estereotáxica para a gaiola de Faraday, certificando-se de que os eletrodos cerebrais profundos não sejam abaixados no cérebro até que a estrutura estereotáxica esteja em sua posição final.
- Conecte os eletrodos ao headstage da configuração eletrofisiológica. Certifique-se de que os eletrodos de referência estejam conectados aos canais de referência apropriados.
- Configure o software de gravação: Filtro passa-banda (0,05-8.000 Hz) e amplifice (ganho 1.500-2.000x) o sinal de dados brutos. Use um filtro LFP e pico online com configurações apropriadas (filtro passa-banda 0,05-250 Hz para LFPs, filtro passa-banda 300-8.000 Hz para MUA). Para todos os filtros, use um filtro do tipo butterworth.
- Configure um limite de pico, se aplicável, para classificação de pico online. A maioria dos softwares de gravação permite a configuração de um limite de pico, que é um valor de amplitude acima do qual um sinal é marcado como um pico pelo software. Esse limite pode ser determinado matematicamente como um fator ou desvio padrão da amplitude média do sinal de pico filtrado ou, preferencialmente, pode ser determinado por inspeção visual de segmentos de dados <500 ms e configurado como uma linha acima do ruído do sinal em uma interface gráfica do usuário.
nota: A intenção de estabelecer um limite de pico é contar picos e classificar unidades para fornecer informações sobre quantos neurônios estão atualmente registrados e como seus picos são moldados.
- Abaixe lentamente os eletrodos de microfios de tungstênio até 1 mm dorsal do alvo, que é STN para via hiperdireta. Aguarde até que o sinal se estabilize, se necessário.
- Para o mapeamento eletrofisiológico, avance os eletrodos ventralmente em passos de 100 μm. Em cada etapa, avalie o padrão de disparo, a taxa de disparo e a forma dos espigões. Compare-os com os exemplos típicos dados na Figura 1. Comumente, núcleos densos mostram picos rápidos e contínuos em vários passos dorsoventrais, enquanto estruturas ricas em fibras mostram baixas taxas de disparo e atividade de pico menos homogênea nos passos ventrais subsequentes.
- Para a via hiperdireta, certifique-se de que o eletrodo mais ventral esteja dentro de STN.
nota: O STN é atingido quando um aumento considerável no MUA é detectado ventral da Zona incerta. Ventral ao STN, o pico pára quase completamente porque o eletrodo atingiu a cápsula interna. Quando o eletrodo mais ventral está em STN, a configuração dos microeletrodos de tungstênio garante que o segundo eletrodo posterior esteja em SNr. O ajuste fino dorsoventral em pequenos incrementos pode ser necessário para registrar o MUA típico em STN e SNr ao mesmo tempo. Observe que a frequência do MUA depende do número de neurônios realmente registrados e do nível de ativação cerebral.
- Quando os eletrodos estiverem nas estruturas desejadas, configure a filtragem on-line e a classificação de picos (consulte a Figura 2) e, em seguida, inicie a gravação dos dados. Exemplos típicos para os diferentes estados de sincronização cortical que podem ser identificados nas gravações LFP são mostrados na Figura 3.
Tabela 1: Coordenadas estereotáxicas para o registro da via hiperdireta dos gânglios córtico-basais. Todos os pontos são medidos a partir do ponto de referência bregma no crânio em mm; n.a.- não aplicável.
| Coordenadas de Bregma | Stn | Snr | M1 | Referência 1 | Referência 2 |
| ântero-posterior | -3,6 | -4,8 | +3.0 | -10,0 | -10,0 |
| médio-lateral | +2,5 | +2,5 | +3.0 | +3.0 | -3,0 |
| dorsal-ventral | -8,0 | n. a. | n. a. | n. a. | n. a. |
