Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação Diária de Aparelhos Experimentais
- Ligue o amplificador, o computador e o sistema de câmera e verifique se o software está em execução.
- Coloque o líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) em um tubo de 50 mL e borbulhe com carbogênio.
- Use uma bomba peristáltica para circular o ACSF. Ajuste a taxa de fluxo para aproximadamente 1 mL / min.
- Ajuste a altura da pipeta de sucção para que o nível do líquido dentro da câmara do experimento seja sempre constante.
nota: O nível da solução é importante para obter um registro estável, portanto, o ajuste deve ser feito por meio de um micromanipulador.
- Instale o eletrodo de aterramento feito de chip amarelo preenchido com ágar KCl 3 M (2%) em um suporte com um fio Ag-AgCl com uma pequena quantidade de solução KCl 3 M.
- Encha uma pequena quantidade de ACSF (aproximadamente dois terços do volume) no eletrodo de vidro (1 mm de diâmetro externo, 0.78 mm de diâmetro interno puxado com um extrator de micropipeta) usando uma ponta amarela de tubo fino e cônico e coloque-o no porta-eletrodo.
- Fixe o suporte à haste instalada no manipulador. Certifique-se usando um amplifier que a resistência do eletrodo é de aproximadamente 1 MΩ.
nota: O eletrodo do tipo patch de abertura larga de haste longa (abertura de 4-8 μm) deve ser bom para gravação em campo e como eletrodo estimulante.
2. Iniciando uma sessão de gravação
- Pegue uma preparação de fatia da câmara úmida com uma pinça.
- Coloque rapidamente a fatia em uma câmara experimental sob o microscópio (Figura 1).
- Empurre a borda do anel firmemente no O-ring de silicone. Tenha cuidado para não romper a membrana ou o fundo da câmara do experimento.
nota: A direção do corte deve ser levada em consideração em relação à direção dos eletrodos de estimulação e registro no campo de visão. A fatia saudável deve grudar no filtro de membrana para que não haja necessidade de usar outros dispositivos para fixar as fatias, como pesos e malhas de náilon.
- Coloque a ponta do eletrodo estimulante e o eletrodo de registro de potencial de campo na fatia sob o microscópio com luz transmitida.
- Use o sistema de registro eletrofisiológico para verificar a resposta. Confirme o registro eletrofisiológico usual (não corado) com a configuração fornecida.
nota: O eletrodo de registro pode ser omitido, mas é útil para verificar a fisiologia da fatia.
- Ajuste a intensidade da luz de excitação para aproximadamente 70-80% da capacidade máxima na câmera que corresponde a 13-15 mW/cm2 na amostra ao amostrar a 10 kHz com lente objetiva de imersão em água 5x e lente tubular 1x PLAN APO. O comprimento de onda da luz de excitação é de 530 nm e o filtro de emissão deve ser > 590 nm.
nota: Use um obturador para minimizar a quantidade de luz de excitação. A exposição contínua à luz pode deteriorar a fisiologia do corte. O possível efeito nocivo da luz depende da intensidade e duração da luz. Use o registro eletrofisiológico para julgar o efeito da luz. No caso de uma força de 13-15 mW/cm2, cerca de 1 s de exposição deve ser o limite superior da tolerância.
- Ajuste o foco com o sistema de aquisição usando a fonte de luz fluorescente, pois o foco pode ser diferente dependendo do comprimento de onda e inicie a aquisição.
- Examine os dados em um software de aquisição de imagens.
nota: Usamos o pacote original de microprogramação do software de análise numérica para análise detalhada.
