Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Animais
- Use camundongos OR-IRES-tauGFP geneticamente modificados (OR = receptor olfatório, IRES = local de entrada do ribossomo interno, tauGFP = proteína fluorescente tau-verde) disponíveis no Laboratório Jackson. Esses camundongos foram desenvolvidos no laboratório do Dr. Peter Mombaerts para analisar o direcionamento do axônio e o desenvolvimento do sistema olfativo. Por exemplo, a linha MOR23-IRES-tauGFP, número de estoque 006643, tem o nome oficial da cepa B6; 129P2-OLFR16tm2Mãe/MãeJ; da mesma forma, a linha SR1-IRES-tauGFP, número de estoque 6717, leva o nome oficial B6; 129P2-Olfr124tm1Mãe/MãeJ.
- Em relação à idade dos animais: para um melhor resultado do protocolo, utilizar animais entre 2 e 4 semanas de idade. Nessa faixa etária, a dissecção é mais fácil (ossos mais moles, epitélio olfatório mais firme) e os botões dendríticos são maiores em comparação com animais mais velhos.
2. Preparação de Eletrodos e Soluções
- Para as pipetas estimulantes: compre pipetas estimulantes pré-puxadas. Caso contrário, prepare-os manualmente.
- Com uma chama, dobre seis pipetas de vidro de 1 mm a cerca de 1 cm da ponta. Insira essas seis pipetas mais um tubo retângulo de 7 em 1,5 cm reforçado por um ilhó.
- O calor encolhe a tubulação para manter os barris presos. Conecte um tubo termorretrátil adicional à outra extremidade dos canos. Puxe esta pipeta estimulante com um extrator de vários cilindros.
- Adicione um pouco de cola líquida branca ao redor do ilhó para fortalecer as pontas dobradas. Deixe secar durante a noite (O/N).
- Prepare 1 ou 2 L de solução extracelular de Ringer normal (em mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, glicose 15; pH 7,6 e 305 mOsm). Conservar a 4 °C até à utilização.
- Preparar a solução-mãe intracelular (em mM): KCl 70, KOH 53, ácido metanossulfónico 30, ácido etilenoglicol tetracético (EGTA) 5, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico (HEPES) 10, sacarose 70; pH 7,2 (KOH) e 310 mOsm. Conservar a 4 °C até à utilização. Bom por várias semanas.
- Prepare a solução de registro intracelular com nistatina extemporaneamente (no último minuto) antes do experimento.
- Pesar 3 mg de nistatina, adicionar 50 μl de dimetilsulfóxido (DMSO); vórtice 20 segundos e sonicar 2-3 min até diluir totalmente.
- Adicionar 20 μl de solução de DMSO-nistatina em 5 ml de solução-mãe intracelular. Vórtice 20 seg, depois sonicar 3 min. Manter esta solução a 4 °C e proteger da luz directa, a nistatina é sensível à luz. Esta solução pode ser usada por algumas horas. Substitua todos os dias.
- Uma vez que a preparação do epitélio olfatório esteja sob o microscópio, tome um pouco dessa solução em uma seringa de 1 ml com uma ponta amarela alongada para encher os eletrodos; proteja da luz direta. Uma vez à temperatura ambiente (TR), a solução de nistatina não é estável; Substitua a solução na seringa de 1 ml a cada hora ou mantenha-a no gelo.
- Puxe os eletrodos de registro com um extrator para obter pescoço longo e ponta pequena (~ 2 μm) com uma resistência de 15-20 MΩ com a solução interna de nistatina.
- Preparar a solução odorífera a 0,5 M em DMSO sob hotte; alíquota e conservar a -20 °C até à utilização. Diluir o odor na solução de Ringer até a concentração desejada. Encha a pipeta estimulante.
3. Preparação do Epitélio Olfatório
Nota: Os camundongos OR-IRES-tauGFP expressam o tauGFP sob o controle do promotor OR. Nesses camundongos, todos os neurônios que expressam o OR de interesse são marcados com GFP. Este protocolo é adaptado para salas de cirurgia expressas em todas as zonas. No entanto, dissecções e registros são mais fáceis para ORs expressos na zona dorsal.
- Anestesiar o animal injetando uma mistura de cetamina e xilazina (150 mg/kg e 10 mg/kg de peso corporal, respectivamente). A decapitação pode ser realizada com tesouras afiadas para camundongos jovens ou com uma guilhotina para roedores com manutenção adequada para camundongos mais velhos.
- Usando uma tesoura de dissecação em anel, faça uma incisão medial longitudinal através da pele dorsal. Remova a pele separando-a. Usando a tesoura, corte as mandíbulas inferiores na articulação da mandíbula. Remova os dentes frontais superiores por um corte coronal paralelo aos dentes.
- Faça um corte coronal da cabeça atrás dos olhos e mantenha apenas a parte anterior da cabeça. Mergulhe-o em uma solução de Ringer gelada para a dissecção sob o escopo.
- Dissecar sob o escopo: no lado ventral, faça um corte longitudinal ao longo da mandíbula superior/dentes. Corte os ossos dorsais longitudinalmente, seguindo o lado dorsolateral da cavidade nasal. Remova a maioria dos ossos e palato; transferir o septo e o epitélio ligado a ele em Ringer oxigenado em RT.
- Para a dissecção final: Logo antes de iniciar a sessão de gravação, retire o epitélio do septo subjacente com uma pinça. Separar o epitélio com uma pinça e com dois cortes em tesoura de 4-5 mm (usar tesoura micro-vannas) na parte anterior do septo, onde a adesão é mais forte.
- Remova cuidadosamente o órgão vomeronasal, cortando-o ao longo de sua conexão dorsal com o epitélio septal. Transfira o epitélio para uma câmara de registro com a camada de muco voltada para cima; mantenha-o plano na câmara com uma harpa.
- Instale a câmara sob um microscópio vertical equipado com óptica de fluorescência e uma câmera sensível. Visualize a preparação na tela do computador em alta ampliação por meio de uma objetiva de imersão em água de 40X (abertura numérica de 0,8) e uma ampliação extra de 2X ou 4X obtida por uma lente de aumento. Perfundir continuamente com Ringer oxigenado em RT (1-2 ml / min).
4. Sessão de gravação
- Procure por células fluorescentes: excite a preparação a 480 nm para EGFP, que emite luz na faixa de 530-550 nm; mire em um botão dendrítico que seja visível de forma confiável em fluorescência e sob campo claro.
- Encha o eletrodo com solução intracelular com nistatina; remova as bolhas batendo suavemente no eletrodo.
- Insira o eletrodo no suporte do eletrodo, aplique pressão positiva na pipeta; A resistência deve ser de 15-20 MΩ.
- Aproxime o eletrodo da célula; quando a resistência atingir ~ 40 MΩ, libere a pressão positiva e aplique uma leve pressão negativa para alcançar um gigaseal.
- Uma vez alcançada a vedação, defina o potencial de membrana em cerca de -75 mV;
- Uma vez aberta a célula, prossiga com os protocolos de estimulação, tratamentos farmacológicos. Para medir a resposta a uma única estimulação odorífera, registre 200-500 ms de atividade espontânea, estimule por 500 ms e meça a resposta da célula por até 10 segundos. Para tratamentos farmacológicos, perfundir os agentes farmacológicos na concentração desejada.
