Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Alinhamento do caminho óptico entre a câmera CMOS (semicondutor de óxido metálico complementar) e o patch cord individual ou ramificado
- Afrouxe todos os parafusos do tradutor de 5 eixos (Figura 1B).
- Aparafuse o patch cord (Figura 1B) ao adaptador [SMA (subminiatura A) ou FC (conector de fibra óptica)] que está afixado no tradutor de 5 eixos.
- Ligue a luz de excitação de 470 nm (Figura 1B) em baixa potência (100 μW) e coloque a ponta do patch cord apontando para uma lâmina de plástico autofluorescente. Isso não tem qualquer influência em gravações futuras, mas é apenas para visualizar o processo de alinhamento.
- Grave a partir da câmara CMOS (Figura 1B) no modo em tempo real. Aumente o ganho ou ajuste a tabela de pesquisa (LUT) até que a imagem não fique totalmente preta. O objetivo é ser capaz de ver uma imagem no ponto focal da objetiva (Figura 1B).
- Avance o tradutor de 5 eixos em direção à objetiva, garantindo que a luz de 470 nm esteja centralizada na fibra na extremidade SMA ou FC do patch cord até que uma imagem possa ser resolvida na câmera.
- Ajuste os eixos X e Y até que a imagem esteja centralizada e bem resolvida.
- Visualize a luz emitida pela extremidade da ponteira do patch cord. Deve aparecer como um círculo isotrópico. Se um patch cord ramificado for usado, a quantidade de luz emitida nas extremidades da ponteira de cada patch cord deve ser semelhante. Se o círculo não for isotrópico ou a luz emitida for desigual, ajuste o tradutor de 5 eixos no eixo X-Y.
2. Configuração de ROIs em torno de fibras para medição da intensidade fluorescente média
- Acenda todas as luzes de excitação para visualizar melhor as fibras. Ajuste o ganho da câmera para que nenhum pixel fique saturado e uma imagem nítida das fibras esteja presente.
- Grave ao vivo ou tire uma imagem preliminar.
- Desenhe ROIs ao redor das fibras e guarde-as para medir os valores médios de intensidade durante as gravações (Figura 1A).
- Para gravações de várias fibras, teste a independência nos sinais.
- Gravação ao vivo de todas as fibras.
- Aponte uma fibra para uma fonte de luz e bata com um dedo. Grandes flutuações devem ocorrer apenas nesse canal (vazamento aceitável 1:1000).
- Se os sinais não forem independentes, redesenhe ROIs mais conservadores e repita o teste de independência.
- Para rotular e rastrear qual ROI corresponde a qual fibra, fita colorida ou esmalte pode ser aplicado na extremidade das fibras. Tire uma foto antes do início de qualquer experimento como um lembrete secundário.
3. Configuração da arena de gravação
- Pendure o patch cord acima da arena usando suportes, clamps ou suportes.
- Certifique-se de que o animal possa se mover livremente por toda a arena, desinibido pelo comprimento da fibra.
- Se uma caixa operante ou campo aberto for usado, certifique-se de que o cabo de conexão possa alcançar o animal com o mínimo de flexão. Se isso exigir uma cutucada no nariz, certifique-se de que haja espaço suficiente para evitar a dobra da fibra. Evite qualquer flexão ou torção excessiva do patch cord.
4. Gravações in vivo
- Inspecione visualmente a extremidade distal das fibras do patch cord a olho nu e com um microscópio de minifibras. Se a superfície das fibras estiver arranhada, polir novamente as fibras usando filme de polimento/lapidação de fibras com grão fino (1 μm e 0,3 μm).
- Limpe as extremidades distais do patch cord com etanol 70% e um aplicador de ponta de algodão.
- Limpe as cânulas de fibra óptica usando etanol 70% e um aplicador de ponta de algodão.
- Conecte a extremidade da ponteira do patch cord à fibra implantada usando uma luva dividida de cerâmica coberta com um tubo retrátil preto. Certifique-se de que a luva esteja apertada durante a conexão. Caso contrário, use uma nova manga.
nota: Se houver algum espaço entre a ponteira do patch cord e o implante, haverá uma grande perda de sinal e as gravações não funcionarão.
- Permita que o animal se recupere por alguns minutos antes do início do teste comportamental.
- Comece a gravar o sinal óptico e execute o experimento.
- Durante a gravação, fique de olho no rastreamento ao vivo para garantir gravações de qualidade. Espera-se que o sinal diminua rapidamente em função do tempo nos primeiros 2 minutos de gravação. Este efeito é causado pelo decaimento do LED mediado pelo calor, pelo qual o aumento do calor aumenta a resistência do elemento óptico.
- Se ocorrer um salto no sinal que exceda a cinética liga/desliga do GCaMP, isso geralmente indica que a manga não está apertada o suficiente e o espaço entre o patch cord e o implante está mudando. Nesse caso, pare o experimento e reconecte o animal usando uma nova manga.
