Um estudo eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongo

Resumo

Fonte: Chen, X., et al. Investigações eletrofisiológicas da função da sinapse retinogeniculada e corticogeniculada. J. Vis. Exp. (2019).

O vídeo descreve o registro eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongos. Os cortes contendo o núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) são colocados em uma câmara de registro. Uma pipeta estimulante é posicionada no trato óptico para estimular as células ganglionares da retina (RGCs) e investigar sinapses retinogeniculadas ou no núcleo reticular tálamo para estimular neurônios corticais e investigar sinapses corticogeniculadas. Após a estimulação, os RGCs e os neurônios corticais liberam neurotransmissores excitatórios, que produzem correntes sinápticas nos neurônios de retransmissão LGN. Essas correntes são registradas usando uma pipeta de registro patch-clamp.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Soluções

1. Solução de dissecção
   1. Para reduzir a excitotoxicidade, prepare uma solução à base de colina para ser usada durante a dissecção, conforme apresentado aqui (em mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 cloreto de colina, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl₂ e 25 glicose. Prepare a solução de dissecção menos de 1 semana antes do experimento.
2. Solução de gravação
   1. Prepare uma solução de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo (em mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ e 25 glicose. Adicionar 50 μM de ácido D-2-amino-5-fosfonovalérico (D-APV) e 10 μM de bromidrato SR 95531 (gabazina) para bloquear os recetores N-metil-D-aspartato (NMDA) e GABAA, respetivamente.
3. Solução intracelular
   1. Prepare uma solução intracelular contendo (em mM): 35 gluconato de Cs, 100 CsCl, 10 ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), ácido tetracético de etilenoglicol 10 (EGTA) e 0,1 D-600 (cloridrato de metoxiverapamil). Ajuste o pH para 7,3 com CsOH. Filtrar, alíquota e armazenar a solução-mãe a -20 °C até à utilização.

2. Dissecção

1. Prepare duas câmaras de corte, das quais uma é preenchida com 100 mL da solução de dissecção e a outra com 100 mL de solução de registro. Colocar os dois copos num banho-maria (37 °C) e borbulhar as soluções com carbogénio durante pelo menos 15 minutos antes da dissecação.
2. Encha um copo de plástico com 250 ml de solução de dissecação quase gelada (mas não congelada). Pulverize com carbogênio pelo menos 15 minutos antes de usar.
3. Encha uma placa de Petri plástica (100 mm x 20 mm), na qual será realizada a dissecção cerebral, com a solução de dissecção a frio. Coloque um pedaço de papel de filtro na tampa da placa de Petri.
4. Resfrie a câmara de dissecção do vibratome.
5. Anestesiar um camundongo com 2,5% de isoflurano, por exemplo, na gaiola do rato. Assim que o camundongo não responder a um beliscão da cauda, decapite o camundongo perto da medula cervical e mergulhe a cabeça na solução de dissecação gelada na base da placa de Petri.
6. Corte a pele da cabeça de caudal para nasal e mantenha-a lateralmente com os dedos para expor o crânio. Para retirar o prosencéfalo, primeiro corte o crânio junto com a linha média póstero-anterior e, em seguida, corte mais duas vezes através da sutura coronal e da sutura lambdoide (Figura 1A).
7. Remova o crânio entre a sutura coronal e a sutura lambdoide de forma que o cérebro fique exposto. Corte o bulbo olfatório e separe o prosencéfalo do mesencéfalo com uma lâmina fina (Figura 1B). Retire o cérebro do crânio com uma espátula fina e coloque-o sobre o papel de filtro na tampa da placa de Petri.
   nota: As etapas 2.6 e 2.7 devem ser executadas o mais rápido possível para reduzir a morte celular.
8. Para preservar a integridade das entradas sensoriais e corticais para o dLGN na fatia do cérebro, separe os dois hemisférios com um corte parassagital com um ângulo de 3−5° (Figura 1C, D). Seque os planos mediolaterais dos dois hemisférios colocando-os no papel de filtro e, em seguida, cole-os no estágio de corte com um ângulo de 10−25° em relação ao plano horizontal (Figura 1E).
9. Coloque o stage no centro da bandeja de metal e despeje suavemente o restante da solução de dissecção gelada na bandeja de buffer. Execute esta etapa com cuidado, pois um derramamento forte pode remover o cérebro colado (Figura 1F).
10. Coloque a bandeja tampão na bandeja cheia de gelo, o que ajuda a manter a baixa temperatura durante a dissecação. Corte fatias de 250 μm com uma lâmina de barbear a uma velocidade de 0,1 mm/s e uma amplitude de 1 mm.
11. Manter as fatias na câmara de retenção cheia de solução de dissecação oxigenada a 34 °C durante cerca de 30 min e, em seguida, deixar recuperar as fatias na solução de registo a 34 °C durante mais 30 min.
12. Após a recuperação, remova a câmara de retenção de fatias do banho-maria e mantenha as fatias em temperatura ambiente (RT) até serem usadas em experimentos.

3. Eletrofisiologia

1. Puxe pipetas usando capilares de vidro borossilicato e um extrator de filamento. Mantenha a resistência das pipetas de registro em 3−4 MΩ. Puxe as pipetas estimulantes usando o mesmo protocolo, mas quebre a ponta ligeiramente após puxar para aumentar o diâmetro. Encha as pipetas de registro com a solução intracelular e biocitina, enquanto enche as pipetas estimulantes com a solução de registro.
2. Coloque as fatias na câmara de gravação e perfunda continuamente as fatias com solução de gravação oxigenada em RT. Verifique todas as fatias e selecione aquelas que exibem um trato óptico intacto.
3. Visualize a fatia e as células com um microscópio vertical equipado com microscopia de vídeo de contraste de interferência diferencial infravermelha (IR-DIC).
   nota: Os neurônios de retransmissão são diferenciados dos interneurônios por seu tamanho de soma maior e dendritos mais primários (ramos que emergem do soma). Os interneurônios exibem morfologia bipolar com um soma menor.
4. Coloque a pipeta estimulante na fatia antes de tapar a célula com a pipeta de gravação. Para investigar sinapses retinogeniculadas, coloque a pipeta estimulante diretamente no trato óptico, onde as fibras axônicas das células ganglionares da retina são agrupadas (Figura 2A). Para analisar as sinapses corticogeniculadas, coloque o eletrodo estimulante no núcleo reticular do tálamo, que é rostroventralmente adjacente ao dLGN (Figura 2B).
5. Assim que a pipeta de gravação estiver imersa na solução de gravação, aplique um passo de tensão de 5 mV para monitorar a resistência da pipeta. Defina o potencial de retenção para 0 mV e cancele o potencial de deslocamento para que a corrente de retenção seja 0 pA.
6. Aproxime-se da célula com a pipeta de registro enquanto aplica pressão positiva. Quando a pipeta estiver em contato direto com a membrana celular, libere a pressão positiva e defina o potencial de retenção para -70 mV. Aplique uma leve pressão negativa para permitir que a membrana celular se prenda à pipeta de vidro de forma que se forme uma vedação de gigaohm (resistência >1 GΩ). Compense a capacitância da pipeta e abra a célula pela aplicação de pulsos de pressão negativa.
7. Para investigar a função sináptica, aplique pulsos de corrente de 0,1 ms (ca. 30 μA) através da pipeta de estimulação. Se não forem observadas respostas sinápticas, as pipetas estimulantes podem ter de ser substituídas. Tenha cuidado ao colocar as pipetas estimulantes em uma posição diferente, de modo que a célula registrada não seja perdida.
   nota: Nos registros de exemplo mostrados na Figura 2, a plasticidade sináptica de curto prazo foi investigada estimulando o trato óptico ou as fibras corticogeniculadas duas vezes com intervalos interestímulos de 30 ms. A razão de pulso pareado (PPR) foi calculada dividindo-se a amplitude da segunda corrente pós-sináptica excitatória (EPSC) pela da primeira EPSC (EPSC2/EPSC1). Cada protocolo de estimulação foi repetido 20 vezes. A amplitude do EPSC foi medida a partir das correntes médias das 20 varreduras. O intervalo de tempo entre cada repetição foi de pelo menos 5 s para evitar a plasticidade de curto prazo induzida pelas repetições.
8. Monitore a resistência em série continuamente aplicando um passo de tensão de 5 mV. Use apenas as células com resistência em série menor que 20 MΩ para análise.

Resultados

Figura 1: Esquemas que representam o protocolo de dissecação. (A) Vista horizontal do crânio do rato, mostrando a posição dos cortes iniciais. O primeiro corte foi realizado junto com a sutura sagital, seguido por outros dois cortes junto com a sutura coronal e a sutura lambdoide, respectivamente. Linhas tracejadas representam as incisões. (B) Visão sagital de todo o...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
amplificador	HEKA Elektronik	Amplificador de braçadeira de patch duplo EPC 10 USB
CaCl2	GARANTIR	Rolamento 1.02382.1000
cloreto de colina	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	GARANTIR	Rolamento 1.02038.0100
Cs-gluconato	Auto-preparado		Como não havia gluconato de Cs comercial, nós o preparamos por nós mesmos
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG
D-APV	Biotendência	BN0085-100
Câmera digital para microscópio O	Olimpo	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
glicose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	Roth	Rolamento 9105.2
Isolador de estímulo de alta corrente	Instrumentos de precisão mundiais	Resposta 385
Kcl	GARANTIR	1.04936.1000
MgCl2	GARANTIR	Rolamento 1.05833.0250
Micromanipuladores	Luigs & Neumann	SM7
Miroscópio	Olimpo	BX51
Meio de montagem	ThermoFisher Scientific	Pág. 36930
NaCl	Roth	3957.1
NaH2PO4	GARANTIR	1.06346.1000
NaHCO3	GARANTIR	1.06329.1000
pipeta	Hilgenberg	1807502
Extrator	Sutter	P-1000
Lâmina	Personna	Telefone: 60-0138
Vibratome semiautomático	Leica Biosystems	VT1200S
Bromidrato SR 95531	Biotendência	AOB5680-10	Antagonista do receptor GABAA