Implantando um sistema de microeletrodo bidirecional sem fio em um cérebro de rato

Abstract

Fonte: Melo-Thomas, L., et al., Uma interface bidirecional sem fio para gravação in vivo e estimulação da atividade neural em ratos com comportamento livre. J. Vis. Exp. (2017)

O vídeo demonstra um procedimento para implantar uma unidade de eletrodo multicanal bidirecional sem fio em um cérebro de rato para gravar e estimular redes neurais multicanal.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Animais

1. Ratos Wistar machos adultos (200-250 g) em grupos de 3-4 sob condições laboratoriais padrão por pelo menos uma semana antes da cirurgia para permitir a aclimatação.
2. Dois dias após a cirurgia, ratos domésticos em pares. Cubra gaiolas individuais com tampas de acrílico altas. Evite tampas convencionais feitas de grade de metal, pois os implantes podem ficar presos, aumentando o risco de serem danificados e/ou instáveis com o tempo.

2. Cirurgia estereotáxica

1. Antes de iniciar a cirurgia, organize e prepare os seguintes equipamentos e materiais:
   1. Obtenha equipamento cirúrgico estéril composto por tesouras estéreis, pinças sem corte, espátulas, tesouras cirúrgicas, broca odontológica e cotonetes.
   2. Obtenha medicamentos e produtos químicos, incluindo isoflurano, xilocaína, cloridrato de tramadol, colírio de dexpantenol, peróxido de hidrogênio a 3%, iodopovidona e etanol a 70%.
   3. Obtenha material de fixação, incluindo parafusos de aço inoxidável, resina acrílica, cola ultravioleta e protetor de tampa.
   4. Obtenha uma unidade de microeletrodo, consistindo em (i) um eletrodo único de gravação (microeletrodo de platina de tungstênio isolado com vidro de quartzo, com formato de ponta cônica, diâmetro externo: 80 μm, ponta cônica, impedância a 1 kHz: 500 kOhm) ou um tetrodo (microeletrodo de platina/tungstênio de 4 núcleos isolado com vidro de quartzo, diâmetro externo: 100 μm, ponta cônica, impedância a 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) um eletrodo de estimulação (fio de platina/irídio (90% platina, 10% irídio), diâmetro do núcleo de 125 μm, diâmetro externo de 150 μm, impedância <10 kOhm) conectado a uma placa de contato e (iii) um eletrodo de referência de fio de platina (diâmetro do eixo, 100 μm; Figura 1A).
   5. Obtenha um porta-eletrodo colado com cola solúvel em água na unidade de microeletrodo e teste a funcionalidade com pelo menos 2 h de antecedência (Figura 1B).
   6. Obtenha um sistema conectado convencional que consiste em um pré-amplificador diferencial, um amplificador principal e um amplificador de filtro passa-banda para gravações.
   7. Obtenha material adicional, como luvas, almofada térmica, seringas e soro fisiológico.
   8. Obtenha gaiolas domésticas (C x L x A: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Procedimento
   NOTA: O implante do eletrodo é realizado durante uma cirurgia estereotáxica convencional sob anestesia com isoflurano.
   1. Certifique-se de que o experimentador esteja usando luvas, máscara cirúrgica e jaleco.
   2. Inicie a anestesia colocando o animal em uma câmara de indução (isoflurano 4-5%, fluxo de oxigênio 1 L/min, duração ~5 min).
   3. Teste de perda de reflexos (reflexos da cauda e dos dedos dos pés) com fórceps para confirmar a anestesia profunda.
   4. Coloque a cabeça do animal em uma máscara de anestesia fixada ao redor da barra incisiva superior da estrutura estereotáxica e ajuste a anestesia (isoflurano 2-3%, fluxo de oxigênio 0,7-0,8 L/min).
   5. Fixe e alinhe horizontalmente a cabeça do animal no aparelho estereotáxico usando barras auriculares e barra incisiva superior.
   6. Raspe o campo cirúrgico usando uma tesoura cirúrgica ou uma tesoura e esterilize com iodopovidona.
   7. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia e trate os olhos com colírio de dexpantenol para evitar que sequem.
   8. Injete xilocaína (0,3-0,4 mL, por via subcutânea, s.c.) no centro do campo cirúrgico.
   9. Teste a perda de reflexos novamente.
   10. Faça uma pequena incisão (1,5 cm) com bisturi no meio do campo cirúrgico para expor o crânio. Separe a pele suavemente e remova o tecido residual usando uma pinça, tesoura e uma espátula.
   11. Limpe cuidadosamente o crânio usando cotonetes revestidos de peróxido de hidrogênio.
   12. Faça 4-5 pequenos furos (4,7 mm) no crânio para fixação de parafusos de aço inoxidável.
   13. Conecte a unidade de microeletrodo/suporte de eletrodo ao préamplifier e conecte-o ao micromanipulador estereotáxico (Figura 1B e 1C).
   14. Faça um furo (aproximadamente 7 mm) no crânio acima da área-alvo usando coordenadas de um atlas cerebral de acordo com o animal usado. No presente estudo, posicione as pontas dos eletrodos voltadas para o colículo inferior utilizando as seguintes coordenadas, tendo como referência o bregma: anterior/posterior, −8,8 mm; medial/lateral, 1,5 mm; e dorsal/ventral, 3,5 mm.
   15. Absorva qualquer sangue com cotonetes.
   16. Introduza verticalmente a unidade de microeletrodo até que as pontas dos eletrodos atinjam a área alvo.
   17. Posicione o cabo de aterramento ao longo dos parafusos de aço inoxidável e sob a pele.
   18. Monitore a atividade do pico e ajuste cuidadosamente a posição do eletrodo com o micromanipulador até atingir uma zona de neurônios ativos na estrutura alvo e detecte a atividade neural com uma relação sinal-ruído adequada para classificação de pico.
   19. Fixe a unidade de microeletrodo ao crânio com cola ultravioleta e cubra a placa de contato e os parafusos com resina acrílica.
   20. Injete solução salina fisiológica (1 mL i.p.) e tramadol (25 mg/kg, s.c.) para evitar a desidratação e garantir a analgesia pós-operatória, respectivamente.
   21. Desconecte a unidade de microeletrodo do porta-eletrodo usando uma escova embebida em água.
   22. Pare a anestesia e remova cuidadosamente o rato do quadro estereotáxico. Desconecte o préamplifier da unidade de microeletrodo.
   23. Conecte a proteção da tampa na unidade de microeletrodo implantada e desconecte-a apenas durante os procedimentos experimentais.

Results

Figura 1: Unidade de microeletrodo TWS. (1) gravação de eletrodo único / tetrodo, (2) eletrodo de estimulação, (3) placa de conexão de fibra de eletrodo, (4) cabos de conexão flexíveis, (5) fio terra, (6) placa de conector, (7) conector macho ou fêmea para sistema TWS (A); Unidade de microeletrodo TWS conectada ao pré-amplificador (8) e ao suporte (9); (B) pronto par...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema sem fio Thomas (TWS) versão 2.0	Thomas RECORDING GmbH	AN001165	O Thomas Wireless System (TWS) versão 2.0 é um sistema de telemetria multicanal portátil com laptop, um sistema operacional Microsoft Windows pré-instalado e software de controle TWS. O TWS inclui: amplificador principal pré e programável de 4 canais de baixo ruído com largura de banda fixa, estimulador de corrente constante de canal único para aplicação de pulsos de corrente bifásica, microestimulador programável por software, sistema de conector implantável e uma unidade básica de estágio principal para montagem em um animal. O sistema é fornecido com um transceptor com conexão de porta USB para laptops ou computadores pessoais de mesa, o software de controle executado no sistema operacional Windows da Microsoft. O sistema TWS pode ser usado para estimulação neural extracelular e registro em pequenos animais de comportamento livre (por exemplo, ratos, porquinhos-da-índia). Este sistema pode ser adaptado para ser usado em animais maiores (por exemplo, primatas) também.
Software para Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	incluído em AN001165	O software para o sistema sem fio Thomas está sendo executado no sistema operacional Microsoft Windows e fornece a interface gráfica do usuário (GUI) para o Thomas Wireless System (TWS). A GUI TWS oferece controle completo das funções TWS de gravação de 4 canais e estimulação de 1 canal.
Tetrodo implantável para gravação (4 canais) e estimulação (canal único)	Thomas RECORDING GmbH	AN001132	Tetrodo implantável para gravação (4 canais) e estimulação (canal único) para uso com Thomas Wireless Systems (TWS). Especificações do tetrodo de gravação: material de fibra de tetrodo: fibra de tungstênio de platina isolada com vidro de quartzo, diâmetro externo da fibra de tetrodo: 100μm, forma da ponta D, impedância 0,5-0,8MOHm; Eletrodo de referência: forma da ponta: D; Impedância: 300-500kOhm; Material: quartzglass isolado platina/tungstênio; Especificação do eletrodo de estimulação: material da fibra: platina / irídio, diâmetro: 125μm, isolado com laca, forma da ponta: D, impedância: < 10kOhm, as dimensões do eletrodo podem ser especificadas pelo usuário final
Microeletrodo implantável para gravação (canal único) e estimulação (canal único)	Thomas RECORDING GmbH	AN001118	Microeletrodo implantável para gravação (canal único) e estimulação (canal único) para uso com Thomas Wireless Systems (TWS). Especificações do eletrodo de gravação: material da fibra do eletrodo: fibra de tungstênio de platina isolada com vidro de quartzo, diâmetro externo da fibra do eletrodo: 80μm / 250μm (especifique), forma da ponta D, impedância 0,5-0,8MOHm; Eletrodo de referência: forma da ponta: D; Impedância. 300-500kOhm; Material: quartzglass isolado platina/tungstênio; Especificação do eletrodo de estimulação: material de fibra: platina / irídio, diâmetro: 125μm, isolado em laca, forma da ponta: D, impedância: < 10kOhm
Suporte para implante de eletrodo	Thomas RECORDING GmbH	AN000838	Haste metálica dobrada especial para implantação de microeletrodos para porta-eletrodos padrão. A haste é usada para segurar um eletrodo implantável. O eletrodo implantável é fixado à haste com cola especial solúvel em água Thomas RECORDING (AN001080). (O suporte do eletrodo não está incluído)
Fonte de alimentação do acumulador de substituição para o sistema sem fio Thomas (3,7V/230mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001208	Bateria recarregável de substituição (acumulador) para o sistema sem fio Thomas com capacidade de 230mA para aproximadamente 1h de operação. (tamanho: 27 mm x 20 mm x 6 mm, peso aprox. 6g)
Fonte de alimentação do acumulador de substituição para o sistema sem fio Thomas (3,7V/450mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001209	Bateria recarregável de substituição (acumulador) para o Sistema Sem Fio Thomas com capacidade de 450mA para mais de 1h de tempo de operação. (tamanho: 48 mm x 30 mm x 4 mm, peso aprox. 11g)
Carregador de acumulador para acumulador recarregável Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	AN001207	Carregador de rede elétrica para os acumuladores recarregáveis Thomas Wirless System (TWS) (AN001209 e AN001209)
Cola solúvel em água	Thomas RECORDING GmbH	AN001080	A cola de eletrodo solúvel em água Thomas RECORDING é um produto especialmente selecionado para uso com microeletrodos implantáveis em pesquisas neurocientíficas. Suas propriedades únicas garantem uma conexão rígida entre o eletrodo e o dispositivo de montagem, embora seja facilmente removível com água morna. A cola de eletrodo solúvel em água Thomas RECORDING pode ser usada imediatamente, sem qualquer preparação demorada. Thomas RECORDING cola de eletrodo solúvel em água não é prejudicial aos seres humanos, animais ou ao meio ambiente. Quantidade: 1 caixa de 10 gramas
Pré-amplificador diferencial em miniatura	Thomas RECORDING GmbH	AN000329	O Pré-Amplificador Diferencial Miniatura, Modelo MDPA-2 é um pré-amplificador de entrada diferencial de 2 canais projetado para gravações de baixo ruído de tecido excitável. Destina-se ao registro extracelular em conjunto com a implantação de microeletrodos implantáveis para aplicações de animais em movimento livre com o Thomas Wireless System (TWS). O pré-amplificador diferencial miniatura de 2 canais (MDPA-2) é conectado aos microeletrodos implantáveis para fornecer o estágio inicial de amplificação de dez vezes. Idealmente, os eletrodos de platina/tungstênio isolados com vidro de quartzo Thomas RECORDING são usados para produzir resultados de gravação ideais com altas amplitudes de sinal e baixos níveis de ruído. O MDPA-2 possui entradas adicionais de aterramento comum e eletrodo de referência.
Cabo de conexão	Thomas RECORDING GmbH	AN000330	Cabo de conexão para conectar o pré-amplificador diferencial em miniatura Thomas (MDPA-2) a um amplificador principal e a uma fonte de alimentação do acumulador.
Fonte de alimentação recarregável para o pré-amplificador em miniatura	Thomas RECORDING GmbH	AN000328	Fonte de alimentação do acumulador recarregável para o pré-amplificador diferencial miniatura (MDPA-2).
Carregador de acumulador (EUA)	Thomas RECORDING GmbH	AN000167	Carregador de acumulador para a fonte de alimentação AN000328 (conector de tomada elétrica dos EUA)
Carregador de acumulador (EU)	Thomas RECORDING GmbH	AN000168	Carregador de acumulador para a AN000328 de alimentação (conector de tomada de rede UE)
Pré-amplificador diferencial/amplificador principal/filtro passa-banda	Thomas RECORDING GmbH	AN000677	O amplificador principal TREC AC (LabAmp-03) é um amplificador principal diferencial de canal único para aplicações neurofisiológicas (por exemplo, gravação extracelular com microeletrodos). Este instrumento foi projetado para funcionar com o pré-amplificador diferencial em miniatura, modelo MDPA-2. O canal único do LabAmp-03 contém um estágio de amplificador diferencial de alto ganho e baixo ruído, seguido por filtros de baixa e alta frequência. O amplificador possui dois amplificadores de filtro diferentes, um filtro de atividade de unidade única (SUA) –amplificador e um amplificador de filtro de potencial de campo local (LFP), ambos conectados paralelamente no caminho do sinal. O modo de gravação oferece dois níveis de ganho de sinal (x10, x100) em um primeiro estágio e 4 níveis adicionais (x5, x10, x25 e x50) em um estágio final do amplificador. Cada amplificador tem diferentes características de passagem de banda para atividade de unidade única (SUA) 500Hz...20kHz e potenciais de campo local (LFP) 0,1Hz...140Hz. Um monitor de áudio e um discriminador de janela estão integrados no dispositivo. O LabAmp-03 possui um monitor de áudio integrado com alto-falante. Esta unidade fornece reprodução de áudio de sinais eletrofisiológicos. A unidade combina um amplificador de áudio em um pacote compacto e robusto. Isso é especialmente adequado para monitorar disparos neurais e contrações musculares. A entrada do monitor de áudio é conectada internamente ao SUA-Filter ampsaída do amplificador. O LabAmp-03 é fornecido com fonte de alimentação externa para uma faixa de tensão de operação de energia elétrica de 100-240V AC/50-60Hz.
Osciloscópio USB	Thomas RECORDING GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Este osciloscópio de PC de 2 canais é perfeito para uso móvel em um laptop e instalação permanente em gabinetes de controle, equipamentos industriais e muitas outras aplicações onde é necessário um osciloscópio pequeno, leve e poderoso. Este osciloscópio é conectado à saída de sinal do amplificador principal é para exibição da atividade extracelular registrada durante a implantação dos microeletrodos implantáveis para o Thomas Wireless System (TWS). O usuário pode adquirir os dados de medição através das várias interfaces de dados diretamente no PC com o software para PC incluído.
Gerador de estímulos	Sistemas Multicanal	STG3008-FA	O Gerador de Estímulo para Corrente (STG) e a Estimulação Acionada por Tensão cumprem três funções: estimulação acionada por corrente, estimulação acionada por tensão, controle e temporização. O STG está disponível com 2, 4 ou 8 canais de saída independentes. Apresentando unidades de isolamento integradas para cada canal de saída, o STG é capaz de fornecer qualquer forma de onda arbitrária.
Protetor de tampa para o eletrodo	Thomas RECORDING GmbH	AN001193	Tampa protetora para unidade de eletrodo implantável para o sistema sem fio Thomas
Equipamento cirúrgico			Tesouras, pinças de ponta romba, espátulas, tesouras cirúrgicas, broca odontológica e cotonetes
Drogas e produtos químicos			Isoflurano, xilocaína, cloridrato de tramadol (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Alemanha), colírio de dexpantenol (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Alemanha), peróxido de hidrogênio a 3%, iodopovidona (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Alemanha) e etanol a 70%;
Material de fixação, incluindo			Parafusos de aço inoxidável (BN650 M1,2x5; 4,7 mm), resina acrílica (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Alemanha), cola ultravioleta (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Alemanha) e protetor de tampa (Thomas Recording GmbH, Giessen, Alemanha);
Material adicional			Luvas, almofada térmica, seringas e soro fisiológico.
Instrumento Estereotáxico para Pequenos Animais (SASI)	Thomas RECORDING GmbH	AN000287	O modelo deve ser escolhido de acordo com o animal (rato, porquinho-da-índia, macacos, etc.) utilizado no estudo
Câmera de vídeo	Foco Eterno		EverFocus, modelo: EQ150