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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Soluções para gravações de cortes agudos
- Prepare soluções estoque de 10x solução de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4 e 11 mM D-glicose) em água deionizada pura antes dos experimentos de eletrofisiologia. Conservar a solução a 4 °C em frasco de 1 L sem CaCl2 e MgCl2.
- Prepare a solução de pipeta à base de gluconato de potássio para conter 135 mM de K-gluconato, 1,2 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,2 mM de EGTA, 2 mM de MgCl2, 4 mM de MgATP, 0,4 mM de Tris-GTP, 10 mM de Na 2-fosfocreatina e 2,7–7,1 mM de biocitina para revelação post-hoc da morfologia celular. Ajuste o pH da solução para 7,3 e a osmolaridade para 290 mOsm. Armazenar alíquotas de 1 ml a -20 °C.
2. Gravação de patch-clamp de célula inteira
- Transfira suavemente uma fatia de cérebro contendo o complexo hipocampal com uma pipeta de transferência de vidro feita sob medida para a câmara de registro montada em um microscópio vertical. Uma pipeta de transferência é feita de uma pipeta Pasteur encurtada (diâmetro interno de 6,5 mm) conectada a um bulbo de pipeta de borracha. Perfundir continuamente a câmara de registro (3 mL) com 34 °C (aquecido) aCSF borbulhado com 95%/5% O2/CO2. Defina a velocidade da bomba peristáltica para 2-3 mL/min.
- Examine brevemente a expressão de Chronos-GFP em terminais de axônio na região de interesse com iluminação LED azul (470 nm) e observe com uma objetiva de 4x. A fluorescência GFP é visualizada através de um filtro de emissão apropriado, com uma imagem de câmera CCD exibida na tela do computador.
- Coloque uma âncora de fatia feita de um fio de platina em forma de U com cordas de náilon bem espaçadas ("harpa") na fatia para mantê-la.
- Mude para uma objetiva de imersão de 63x e ajuste o foco. Verifique se há axônios expressando Chronos-GFP e escolha um neurônio piramidal para registro de patch.
- Mova o objetivo para cima.
- Puxe as pipetas usando um extrator de eletrodo Brown-Flaming de vidro borossilicato. O extrator é configurado para produzir pipetas com aproximadamente 1 μm de diâmetro da ponta. Encha as pipetas com solução interna à base de K-gluconato.
- Monte a pipeta no suporte da pipeta no cabeçote. Baixe a pipeta na câmara e encontre a ponta sob a objetiva. A resistência da pipeta deve estar entre 3–8 MΩ. Aplique uma leve pressão positiva com uma seringa de modo a ver um cone de solução saindo da pipeta e abaixe progressivamente a pipeta e a objetiva até a superfície da fatia.
- Remende a célula na configuração de grampo de tensão: aproxime-se do neurônio identificado e pressione delicadamente a ponta da pipeta no soma. A pressão positiva deve produzir uma covinha na superfície da membrana. Libere a pressão para criar uma vedação de giga-ohm (resistência de >1 GΩ). Uma vez selado, defina a tensão de retenção para -65 mV. Quebre a membrana com um pulso agudo de pressão negativa: isso é conseguido aplicando forte sucção a um tubo conectado ao porta-pipetas.
- Registre no modo de pinça de corrente de célula inteira as respostas do neurônio às etapas de corrente hiperpolarizante e despolarizante (Figura 1A).
nota: Este protocolo será usado para determinar as propriedades intrínsecas ativas e passivas da célula. Rotinas MATLAB personalizadas são usadas para análise off-line.
- Registre as respostas pós-sinápticas de pinça de corrente ou tensão à estimulação de LED de 475 nm de campo inteiro de fibras aferentes que expressam Chronos. Estimule com trens de 10 estímulos de 2 ms de duração a 20 Hz (Figura 1 B, C). A intensidade da luz pode variar de 0,1–2 mW.
nota: A intensidade da luz foi medida com um console de potência óptica portátil digital equipado com um sensor de fotodiodo, posicionado sob a objetiva. Latências de resposta de 2 a 4 ms são características de uma conexão monossináptica.
