Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação de hardware e software para gravações multicanal
- Configure um sistema de aquisição de dados de 16 canais de acordo com as instruções do fabricante.
nota: Vários amplificadores e sistemas de aquisição de dados disponíveis comercialmente podem ser usados para coletar gravações multicanal. Nos experimentos descritos aqui, os sinais analógicos são entregues por meio de um painel de referência de eletrodos a dois amplificadores, onde são amplificados (2000x) e filtrados (0,1-10kHz). As entradas analógicas para o sistema de aquisição de dados são digitalizadas a 40kHz.
- Prenda o adaptador de estágio de cabeçote de 16 canais apropriado a um micromanipulador de microscópio. Oriente o adaptador de forma que as portas do conector fêmea fiquem voltadas para baixo.
- Ajuste o ângulo de operação deste micromanipulador de forma que fique orientado para baixo em direção à câmara de gravação em um ângulo de aproximadamente 70° em relação à horizontal.
- Conecte a entrada do headstage a uma sonda 16 x 1 para eletrofisiologia in vitro através do adaptador do estágio do cabeçote ancorado ao micromanipulador.
- Conecte o conector de saída do estágio principal ao sistema de aquisição de dados.
- Instale o software apropriado para aquisição de dados. Configure 15 canais de entrada para corresponder aos sinais de entrada dos primeiros 15 contatos de sonda multicanal. Configure o canal restante para receber entrada do eletrodo intracelular.
nota: Ao coletar e analisar dados, tome cuidado para considerar os mapas de eletrodos e adaptadores para garantir que o sinal apropriado corresponda ao contato do eletrodo do qual foi coletado.
2. Configuração de protocolos de estimulação luminosa
- Configure um sistema de fornecimento de luz e instale o software que o acompanha.
- Abra o software. Escolha uma configuração de fiação de hardware na qual uma fonte de disparo (saída digital/TTL (lógica transistor-transistor)) forneça um sinal de disparo para o sistema de entrega de luz, e o sistema de fornecimento de luz forneça um sinal de disparo para um LED de 470 nm (diodo emissor de luz).
- Monte a lente objetiva de alta potência. Usando uma câmera digital, calibre as objetivas de alta potência com o sistema de entrega de luz.
- Crie uma nova sequência de perfis de estimulação de luz.
- Crie um padrão de escolha. Nos experimentos descritos aqui, um círculo de 150 μm de diâmetro permite a ativação específica da camada dos terminais axônicos.
- Para construir uma sequência de perfil, copie e cole esse perfil para cada um de qualquer número de tentativas.
- Crie uma lista de formas de onda que contenha formas de onda de qualquer intensidade de luz, duração de pulso ou número de pulso.
- Atribua aleatoriamente formas de onda a cada perfil. Cada perfil com sua forma de onda atribuída corresponde a um pulso de disparo de uma entrada TTL digital ou um teste.
- Salve a sequência de perfil.
- No software de aquisição de dados, crie um novo protocolo.
- Defina o número de tentativas para igualar o número de perfis na sequência de perfis criada.
- Escolha as entradas de sinal para corresponder às configuradas na Etapa 1.6. Configure um protocolo que forneça uma única saída TTL digital, gravando a partir desses 16 canais de entrada por um período de tempo apropriado antes e depois do disparo digital.
3. Colocação de sonda multicanal em fatia de tecido cerebral ex vivo
- Perfuse eACSF borbulhado (líquido cefalorraquidiano artificial experimental) (não em sacos selados) a 3-6 mL / min.
- Transfira a fatia do cérebro contendo uma área de interesse para a grade de malha em uma câmara de perfusão do microscópio. Âncora com harpa de platina
- Gire a grade de malha de modo que a linha de contatos do eletrodo na extremidade distal da sonda multicanal seja aproximadamente perpendicular à superfície pial.
- Abaixe a sonda multicanal em direção à superfície da fatia sob iluminação de campo amplo e controle preciso do micromanipulador.
- Gire a torre do cubo de filtro para engatar o cubo de filtro apropriado para visualizar a proteína repórter fluorescente expressa nos terminais axônicos de aferentes corticais. Se necessário, gire a fatia para alinhar com mais precisão a sonda com a superfície pial.
- Posicione a sonda logo acima do plano da fatia, ~ 200 μm abaixo da posição final do alvo ao longo do eixo x, deixando pelo menos um canal fora do limite da área de tecido que está sendo registrada.
- Insira lentamente a sonda na fatia movendo o manipulador ao longo de seu eixo longitudinal. Para minimizar os danos ao tecido, avance a sonda apenas até o ponto em que as pontas afiadas fiquem visíveis abaixo da superfície do tecido. Isso minimizará os danos ao tecido e, ao mesmo tempo, garantirá que os contatos do eletrodo estejam em contato com o tecido.
4. Patch clamping de neurônios direcionados e obtenção da configuração de células inteiras
- Mude a fonte eACSF para a solução Control ensacada.
- Identifique células marcadas com fluorescência para gravação de patch clamp direcionada.
- Restrinja a abertura do diafragma da íris ao menor diâmetro. Envolva uma lente objetiva de baixa potência e coloque o tecido em foco.
- Centralize a luz sobre uma área de tecido adjacente (mas não sobreposta) à sonda multicanal.
- Engate a objetiva de imersão em água de alta potência (40x ou 60x), tomando cuidado para evitar o contato entre a sonda multicanal e a lente objetiva.
- Gire a torre do cubo do filtro para engatar o conjunto de filtros apropriado para permitir a imagem de células que expressam o marcador fluorescente dependente de Cre.
- Identifique uma célula marcada com fluorescência como um alvo para gravação de patch clamp. Levante a lente objetiva para criar amplo espaço para abaixar uma pipeta de remendo.
- Carregue uma pipeta de remendo (consulte a Tabela 1) com solução interna (Tabela 2) e monte a pipeta no suporte do eletrodo. Usando uma seringa de 1 mL, aplique pressão positiva correspondente a ~0,1 mL de ar.
- Abaixe a pipeta de adesivo na solução. Traga a ponta da pipeta em foco sob orientação visual.
- Obtenha o registro de toda a célula da célula-alvo usando as etapas demonstradas anteriormente33.
- Se estiver planejando avaliar mudanças nas propriedades intrínsecas da célula (por exemplo, resistência de entrada, taxa de disparo do potencial de ação em resposta às etapas atuais), conduza essas gravações. Caso contrário, vá para o protocolo de estimulação do axônio abaixo.
Tabela 1: Composição do líquido cefalorraquidiano artificial e solução intracelular. Reagentes e concentrações para eACSF e solução de pipeta intracelular para registros de patch clamp são listados.
| Experimento ACSF, eACSF (em mM) |
| NaCl | 111 |
| NaHCO3 | 35 |
| HEPES | 20 |
| Kcl | 1.8 |
| CaCl2 | 2.1 |
| MgSO4 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 |
| glicose | 10 |
| Solução Interna |
| K-gluconato | 140 |
| NaCl | 10 |
| HEPES | 10 |
| EGTA | 0,1 |
| MgATP | 4 |
| NaGTP | 0,3 |
| pH = 7,2 |
