Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparações pré-cirúrgicas
- Preparação da solução do eletrodo
- Para fazer a solução de preenchimento do eletrodo, prepare uma solução de acetato de potássio 4 M com cloreto de potássio 140 mM.
- Preparação do eletrodo
- Usando sucção a vácuo, insira uma fibra de carbono T-650 (7 μm de diâmetro) em um capilar de vidro borossilicato (comprimento = 100 mm, diâmetro = 1,0 mm, diâmetro interno = 0,5 mm).
- Uma vez que a fibra de carbono tenha sido colocada dentro do capilar de vidro, coloque o capilar de vidro em um extrator de eletrodo vertical, com o elemento de aquecimento aproximadamente no meio do capilar. Defina o aquecedor para 55 com o ímã desligado.
- Depois que o capilar for puxado, levante cuidadosamente o suporte capilar superior para que a ponta do eletrodo não fique cercada pelo elemento de aquecimento.
- Usando uma tesoura afiada, corte a fibra de carbono que ainda está conectando as duas peças do capilar. Isso resultará em dois microeletrodos de fibra de carbono separados.
- Sob um microscópio de luz, corte cuidadosamente a fibra de carbono exposta com um bisturi afiado para que ela se estenda aproximadamente 75-100 μm além da extremidade do vidro.
- Usando um microscópio óptico, certifique-se de que o eletrodo esteja livre de rachaduras ao longo do capilar e que a vedação por onde a fibra de carbono sai do capilar seja difícil de perceber e livre de rachaduras.
nota: Uma boa vedação ajudará a reduzir o ruído durante as gravações.
- Fabricação de eletrodos de referência
- Solde um alfinete de ouro a um fio de prata de 5 cm.
- Conecte o ânodo a um clipe de papel de metal ou outro condutor, o cátodo a um pino e aplique uma tensão (~ 2 V) enquanto o clipe de papel e o fio de prata estão submersos em HCl de 0.1 M.
- Cesse a tensão assim que um revestimento branco (AgCl) aparecer no fio de prata.
- Preparando eletrodos para implantação
- Solde um pino de ouro a um fio isolado fino (~ 10 cm de comprimento, <0,50 mm de diâmetro).
- Remova ~ 5 cm de isolamento do fio oposto ao pino de ouro.
- Encha o eletrodo aproximadamente até a metade com a solução do eletrodo.
- Insira o fio isolado no eletrodo.
nota: O fio deve fazer contato com a fibra de carbono dentro do eletrodo.
2. Implantes de eletrodos
- Dê a ratos Sprague Dawley adultos, machos (250-450 g) uma injeção intraperitoneal (1,5 g / kg ou 1 mL / kg de volume) de 0,5 g / mL de uretano dissolvido em solução salina estéril. Comece com uma dose inicial de uretano de 1,0−1,2 g/kg. Se o animal ainda responder ao teste de estímulo nocivo (pinçamento da cauda) 20 minutos após a administração de uretano, administre um adicional de 0,3 a 0,5 g / kg de uretano para uma dose total de 1,5 g / kg><.
nota: Para preparar a solução de uretano 0,5 g / mL, adicione 10 g de uretano a 10 g (~ 10 mL) de solução salina. O uretano é cancerígeno e deve ser manuseado com cuidado. No entanto, é um anestésico importante, pois não altera os níveis de dopamina, como outros anestésicos, como cetamina / xilazina e hidrato de cloral.
- Uma vez que o animal esteja profundamente anestesiado e não responda a estímulos nocivos (por exemplo, beliscão do dedo do pé), coloque-o no quadro estereotáxico. Aplique lubrificante oftálmico em cada olho do rato.
nota: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência, mas uma boa técnica asséptica é incentivada.
- Limpe o couro cabeludo do rato usando uma esfoliação de dois estágios (ou seja, uma esfoliação de iodopovidona seguida de uma esfoliação com etanol a 70%; execute com uma repetição de 3 ciclos).
- Corte o tecido do couro cabeludo usando uma pinça de nariz esterilizada e uma tesoura cirúrgica. Remova uma quantidade significativa de tecido para abrir espaço para os vários implantes descritos abaixo.
- Limpe suavemente a superfície do crânio usando aplicadores de ponta de algodão esterilizados. Em seguida, aplique 2−3 gotas de peróxido de hidrogênio a 3% para ajudar a identificar o lambda e o bregma.
- Usando uma broca estereotáxica ou manual (1,0 mm, ~ 20.000 rpm), faça um orifício de 1,5 mm de diâmetro 2,5 mm anterior ao bregma e 3,5 mm lateral ao bregma. Parcialmente (cerca de metade, até que esteja firmemente no lugar) implante um parafuso (1,59 mm de diâmetro externo, 3,2 mm de comprimento) neste orifício. Recomenda-se o uso de solução salina estéril para irrigar durante a perfuração para evitar lesões térmicas.
- Para o eletrodo de referência, faça um orifício de 1,0 mm de diâmetro 1,5 mm anterior e 3,5 mm lateral ao bregma, no hemisfério esquerdo.
- Com a mão, insira ~ 2 mm de fio de referência neste orifício enquanto enrola o fio de referência ao redor e sob a cabeça do parafuso implantado.
- Implante totalmente o parafuso, prendendo o eletrodo de referência no lugar.
- No hemisfério direito, faça um orifício de 1,5 mm de diâmetro 1,2 mm anterior e 1,4 mm lateral ao bregma.
- Remova suavemente a dura-máter usando uma pinça.
- Para o eletrodo de estimulação, faça um orifício quadrado (2 mm ântero-posterior, 5 mm medial-lateral) centrado em 5,2 mm posterior e 1,0 mm lateral ao bregma.
- Usando as barras de braço estereotáxicas, abaixe o eletrodo estimulante bipolar/cânula guia 5 mm abaixo da dura-máter. Em caso de sangramento durante o implante do eletrodo, use cotonetes estéreis e gaze para minimizar o sangramento.
nota: O eletrodo estimulante bipolar usado neste método é pré-equipado com uma cânula guia (Tabela de Materiais). A cânula interna usada com este item deve ser lavada com as pontas do eletrodo estimulante bipolar quando totalmente inserida na cânula guia. Isso permitirá que a cânula interna fique diretamente entre as duas pontas do estimulador, que ficam a cerca de 1 mm de distância. Um protocolo semelhante é descrito em outro lugar.
- Usando as barras de braço estereotáxicas, abaixe o microeletrodo de fibra de carbono 4 mm abaixo da dura-máter. Esta localização está na porção mais dorsal do estriado.
- Conecte o fio de referência e a fibra de carbono a um potenciostato.
- Aplique uma forma de onda triangular (-0,4−1,3 V, 400 V/s) por 15 min a 60 Hz e novamente por 10 min a 10 Hz.
nota: Normalmente, ao aplicar formas de onda a microeletrodos de fibra de carbono no cérebro, grupos de óxido são adicionados à superfície da fibra de carbono. O equilíbrio desta reação deve ser alcançado antes do registro; caso contrário, ocorrerá um desvio significativo19. O ciclo do eletrodo em frequências mais altas (60 Hz) permite que a fibra de carbono atinja o equilíbrio mais rapidamente.
3. Otimizando a fibra de carbono e estimulando a localização dos eletrodos/cânulas guia
- Defina o estimulador para produzir uma forma de onda elétrica bipolar, com frequência de 60 Hz, 24 pulsos, corrente de 300 μA e largura de pulso de 2 ms/fase.
- Abaixe suavemente o estimulador em incrementos de 0.2 mm de 5 mm a 7.8 mm abaixo da dura-máter. A cada incremento, estimular o VTA.
nota: Em profundidades mais dorsais (5−6 mm), a estimulação do cérebro normalmente (~ 80% do tempo) faz com que os bigodes do rato se contraiam. Em profundidades maiores, os bigodes param de se contorcer, o que ocorre entre 7,5 e 8,2 mm abaixo da dura-máter. Quando os bigodes pararem de se contorcer, o eletrodo estimulante estará próximo ou próximo ao VTA. Isso não ocorrerá em todos os ratos, e a falta de espasmos nos bigodes não deve ser considerada um sinal de que o eletrodo estimulante bipolar / cânula de infusão está mal colocado. Contrações musculares podem não ocorrer para todos os anestésicos (por exemplo, isoflurano).
- Continue a abaixar o eletrodo/cânula guia de estimulação bipolar até que uma estimulação produza liberação fásica de DA no microeletrodo de fibra de carbono (atualmente no estriado dorsal).
nota: A liberação de DA no estriado dorsal nem sempre ocorrerá se o eletrodo bipolar for implantado no VTA, mas a observação da liberação de DA no estriado dorsal após a estimulação do VTA geralmente é um bom sinal de que um bom sinal será observado no núcleo do NAc.
- Abaixe o microeletrodo de fibra de carbono até que esteja pelo menos 6.0 mm abaixo da dura-máter. Esta é a parte mais dorsal do núcleo NAc.
- Estimular o VTA e registar a amplitude do pico do pico DA.
- Abaixe ou levante o microeletrodo de fibra de carbono no local que produz a maior liberação de DA.
- Certifique-se de que o pico de resposta do DA seja um pico de oxidação claro em 0.6 V e um pico de redução em -0.2 V. Esses picos indicam DA.
4. Registro de FSCV de infusão e estimulação combinados
NOTA: A Figura 1 mostra a linha do tempo para registro antes e depois da microinfusão de VTA.
- Uma vez que a fibra de carbono e a localização da cânula guia / eletrodo estimulante tenham sido otimizadas, estimule por ~ 20−30 min.
nota: Sob os parâmetros de estimulação atuais, não estimule mais do que uma vez a cada 3 min, para permitir a recarga vesicular22.
- Depois de atingir uma linha de base estável (variação de <20% em cinco estímulos), abaixe suavemente a cânula interna manualmente na cânula guia que está pré-encaixada no estimulador bipolar.
- Faça 2 a 3 gravações adicionais da linha de base para garantir que a inserção da cânula em si não altere o sinal evocado. Em alguns casos, a inserção e remoção da cânula interna pode danificar o VTA. Se o sinal mudar drasticamente durante esse período de linha de base (>20%), faça 3 a 4 gravações adicionais até que a linha de base se estabilize novamente.
- Usando uma bomba de seringa e uma microseringa, infundir 0,5 μL de solução (por exemplo, solução salina a 0,9%, N-metil-D-aspartato [NMDA], ácido (2R)-amino-5-fosfonovalérico [AP5]) no VTA durante um período de 2 minutos.
- Após a infusão, deixe a cânula interna por pelo menos 1 min antes da remoção.
nota: Alguns medicamentos podem exigir que a cânula interna seja deixada por mais tempo com base na cinética do medicamento, e a remoção da cânula interna pode fazer com que o medicamento volte pela cânula interna. Se houver preocupação, pode-se deixar a cânula interna na cânula guia durante toda a gravação. Caso contrário, a gravação pode começar após esse intervalo de 1 minuto.
- Continue gravando a cada 3 min para medir os efeitos pós-infusão.
nota: Se infundir uma solução de controle, e nenhum efeito for observado, é possível infundir uma segunda vez10. Se houver liberação alterada de DA causada pela inserção da cânula interna ou infusão de solução salina, o sinal normalmente se recupera para a linha de base em 30 minutos.
