Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Selagem celular para gravação
- Certifique-se de que todos os equipamentos (microscópio, amplificador, digitalizador, micromanipulador e outros) estejam ligados antes de iniciar a gravação.
- Encha a câmara de registro, de uma marca comercial (Tabela de Materiais), conecte ao microscópio com a solução aCSF para registros. Use uma bomba de perfusão para perfundir constantemente o aCSF a uma taxa de 2 mL / min.
- Transfira uma fatia de cérebro de interesse (uma de cada vez) para a câmara de gravação. Use uma pipeta de transferência de acrílico (pipeta de vidro Pasteur invertida conectada a uma tetina de silicone) para transferir as fatias hipotalâmicas para a câmara. Use uma âncora de fatia (Tabela de Materiais) para segurar a fatia de forma que ela não se mova durante a perfusão do aCSF.
- Coloque uma fatia no centro da câmara de gravação conectada ao microscópio. A posição do corte é fundamental para permitir uma boa visualização da região desejada ao microscópio e para um alcance perfeito da micropipeta de registro.
- Use a lente objetiva de baixa potência de um microscópio de imersão (10x ou 20x) para auxiliar no posicionamento da fatia e na localização da região de interesse.
- Depois de localizar a região de interesse, mude a lente objetiva para a lente de alta potência (63x) e concentre-se no nível do tecido, observando a proteína fluorescente endógena e as formas das células na região alvo para localizar as células de kisspeptina na superfície da fatia cerebral.
- Quando uma possível célula de destino for localizada, marque-a na tela do computador com o cursor do mouse ou desenhando um formato, como um quadrado, sobre a área de interesse. A marca da tela do computador ajuda a guiar a posição da micropipeta de gravação até a célula.
- Depois de determinar a localização exata da célula-alvo, levante a objetiva e introduza a micropipeta de registro cheia com a solução interna. Ao colocar a micropipeta no porta-eletrodos, certifique-se de que a solução interna esteja em contato com o eletrodo de prata.
nota: Para preparação, colocação e posicionamento de micropipetas no suporte do eletrodo.
- Aplique pressão positiva antes de submergir a micropipeta na solução de aCSF, para evitar que detritos entrem na micropipeta, usando uma seringa cheia de ar de 1-3 mL conectada ao porta-micropipeta através de um tubo de polietileno (≈130 cm mais longo); aplique quase 100-200 μL de ar.
- Usando o micromanipulador, guie a micropipeta abaixo do centro da objetiva. Mova os botões do micromanipulador para guiar a micropipeta no eixo XYZ em direção à célula de interesse.
- Ajuste o foco para ver a ponta da micropipeta e aproxime o foco, mas não muito perto, da fatia. Reduza a velocidade do micromanipulador e abaixe lentamente a micropipeta até o plano de foco. Certifique-se de que a ponta da micropipeta não penetre abruptamente na fatia, mas desça lentamente até tocar a superfície da célula/região alvo.
- Aplique uma leve pressão positiva (≈100 μL) com a seringa cheia de ar de 1-3 mL conectada ao suporte da micropipeta para limpar quaisquer detritos do caminho de aproximação.
- Concentre-se na célula-alvo e mova lentamente o micromanipulador no eixo XYZ para aproximar a micropipeta dela. Ao tocar a micropipeta na célula, será observada uma covinha causada pela pressão aplicada através da ponta da micropipeta (Figura 2C).
- Após formar a covinha, devido à proximidade da micropipeta com a célula, aplique uma sucção fraca e breve por via oral (1-2 s) através do tubo conectado ao porta-micropipeta para gerar a vedação entre a micropipeta e a célula (vedação gigaohm ou gigaseal >1 GΩ; Figura 2D). Para formar a vedação, use o modo de grampo de tensão no software.
- Se a vedação permanecer estável (a vedação gigaohm deve ser mecanicamente estável e sem interferência de ruído, determinada por observação por cerca de 1 min), defina a tensão de retenção no potencial de repouso fisiológico mais próximo da célula de interesse. Para neurônios hipotalâmicos de kisspeptina, recomenda-se -50 mV.
- Aplique uma breve sucção por via oral (pressão negativa) com a micropipeta selada à célula para romper a membrana plasmática ( Figura 2E ). A configuração adequada de toda a célula é alcançada quando a sucção é realizada com força suficiente para que a membrana rompida não obstrua a micropipeta e não atraia uma porção considerável da membrana ou mesmo da célula.
- Verifique o manual de configurações do sistema usado. Use o software (consulte a Tabela de Materiais) para verificar e calcular digitalmente a resistência em série (SR) e a capacitância de toda a célula (WCC).
- No modo de grampo de tensão, após quebrar a membrana celular, habilite a opção de célula inteira e clique no comando Automático referindo-se à guia de célula inteira. O SR e o wcc da célula serão calculados automaticamente e exibidos instantaneamente pelo software. Esses parâmetros também podem ser verificados realizando o teste de membrana com o amplificador mencionado na Tabela de Materiais.
- Certifique-se de verificar os parâmetros de viabilidade da célula. Para neurônios de kisspeptina, verifique se as medidas eletrofisiológicas são: SR < 25 mΩ, resistência de entrada > 0,3 GΩ e valor absoluto de corrente de retenção < 30 pA. O valor médio do WCC dos neurônios AVPV / PeNKisspeptin ou ARHkisspeptin é ≈ 10-12 pF em camundongos intactos às gônadas.
- Monitore o SR e a capacitância de estado estacionário da célula durante os experimentos. Certifique-se de que o SR não mude mais de 20% durante uma gravação e que a capacitância da membrana esteja estável.
- Verifique as configurações do software. Crie protocolos específicos para as gravações de acordo com o tipo de experimento. Para registrar o potencial de membrana no modo de pinça de corrente, com equipamentos mencionados na Tabela de Materiais, filtre os sinais eletrofisiológicos em 2-4 kHz e analise os resultados offline no software (consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre o software).
- Uma vez que a configuração de toda a célula seja alcançada corretamente, meça as correntes sinápticas no modo de pinça de tensão (Figura 2G). Registre as alterações no potencial de membrana em repouso (RMP) e as variações induzidas de RMP no modo de pinça de corrente (Figura 2H). Alterações na RMP, como a despolarização da membrana celular, podem ser induzidas pela administração de uma droga/neurotransmissor conhecido no banho (descrito na etapa 1.2), conforme ilustrado na Figura 1.
nota: No modo de pinça de corrente, a corrente positiva ou negativa pode ser injetada para manter a tensão da membrana em uma tensão desejada. Para neurônios de kisspeptina, geralmente definimos injeção de corrente zero (I = 0) para registrar a variação espontânea do potencial de membrana.
