Avaliação baseada em matriz de microeletrodos de redes neuronais em fatias da medula espinhal de camundongos

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Eletrofisiologia in vitro

1. Preparação de soluções para preparação e registro de fatias da medula espinhal
   1. Líquido cefalorraquidiano artificial
      nota: O líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) é usado em uma câmara de incubação de interface, onde as fatias são armazenadas até o início do registro e durante os experimentos como perfusato e diluente para drogas. Consulte a Tabela 1 para a composição detalhada.
2. Prepare aCSF contendo (em mM) 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 10 glicose, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ e 2,5 CaCl₂ adicionando as quantidades necessárias do acima, excluindo CaCl₂, a 2 L de água destilada.
3. Borbulhar a solução acima com carbogênio (95% O₂, 5% CO₂) por 5 min e adicionar CaCl₂.
   nota: Esta etapa evita a precipitação de CaCl₂, ou seja, a solução não deve ficar turva. Para aplicação de medicamentos durante experimentos, dilua as soluções estoque de medicamentos em aCSF até as concentrações finais desejadas.

2. Líquido cefalorraquidiano artificial substituído por sacarose

NOTA: O aCSF substituído por sacarose é usado durante a dissecção e o corte da medula espinhal. Como indicado pelo nome, a sacarose é substituída pelo NaCl para reduzir a excitação neuronal durante esses procedimentos, mantendo a osmolaridade. Consulte a Tabela 1 para a composição detalhada.

1. Prepare aCSF substituído por sacarose contendo (em mM) 250 sacarose, 25 NaHCO₃, 10 glicose, 2,5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ e 2,5 CaCl₂ adicionando as quantidades necessárias de todos os itens acima, excluindo CaCl₂, a 300 mL de água destilada.
2. Borbulhe a solução com carbogênio por 5 min e adicione CaCl₂.
3. Conservar a solução num congelador a -80 °C durante cerca de 40 minutos ou até que a solução forme uma pasta. Evite congelar sólidos e use enquanto estiver na consistência de pasta.

3. Preparação da matriz de microeletrodos

NOTA: A superfície de contato do MEA requer um pré-tratamento para torná-lo hidrofílico.

1. Antes do experimento, encha o poço MEA com soro fetal bovino (FBS) ou soro de cavalo (HS) por 30 min.
2. Remova o FBS ou HS e enxágue bem o MEA com aproximadamente cinco lavagens de água destilada até que a água destilada não fique mais espumosa. Encha o poço com aCSF, pronto para uso.

4. Preparação aguda do corte da medula espinhal

1. Anestesie profundamente o camundongo com 100 mg / kg de cetamina (ip) e decapite-o usando uma grande tesoura cirúrgica.
2. Remova a pele sobre a região abdominal fazendo um pequeno corte na pele ao nível dos quadris. Puxe a pele de cada lado do corte rostralmente até que toda a pele seja removida, ou seja, do topo da caixa torácica até o topo da pelve (ventral e dorsalmente).
3. Coloque o corpo no gelo e use uma abordagem ventral para expor a coluna vertebral, removendo todas as vísceras e cortando as costelas laterais ao esterno.
4. Remova a caixa torácica ventral, ambas as escápulas (cortadas em aproximadamente T2) e os membros inferiores e a pelve (cortadas aproximadamente no topo do sacro).
5. Transfira a coluna vertebral e a preparação da costela para um banho de dissecação contendo sacarose gelada aCSF. Prenda todos os quatro cantos da preparação (superfície ventral para cima) colocando pinos nos músculos da parte inferior das costas e nas costelas superiores anexadas.
6. Remova todo o músculo e tecido conjuntivo que cobre a superfície ventral das vértebras com rongeurs e identifique a região vertebral sobre o alargamento lombossacral, que fica aproximadamente abaixo dos corpos vertebrais T12 a L2.
7. Remova um corpo vertebral que é caudal à região de alargamento lombossacral para fornecer acesso à medula espinhal enquanto ela fica no canal vertebral.
8. Usando uma tesoura de mola curva, corte os pedículos vertebrais bilateralmente enquanto levanta e puxa o corpo vertebral rostralmente para separar os aspectos ventral e dorsal das vértebras e expor a medula espinhal.
9. Uma vez que os corpos vertebrais são removidos para revelar o aumento lombossacral, limpe cuidadosamente as raízes restantes que ancoram a medula espinhal com uma tesoura de mola até que a medula flutue livremente.
10. Isole a medula espinhal com cortes rostral e caudal bem acima e abaixo do aumento lombossacral, permitindo que a região-alvo da medula 'flutue livremente'
    nota: A orientação de fatia preferida determinará como o cabo é posteriormente montado para seccionamento (Figura 1).
11. Para fatias transversais, levante o segmento lombossacral por uma raiz anexada e coloque-o em um bloco de poliestireno (isopor) pré-cortado (1 cm x 1 cm x 1 cm) com um canal raso cortado no centro. Use adesivo de cianoacrilato (consulte a Tabela de Materiais) para prender o bloco e o cabo à plataforma de corte e coloque-o no banho de corte contendo sacarose gelada aCSF (pasta).
    nota: O canal raso ajuda a proteger e orientar a medula espinhal, com o lado dorsal exposto e a extremidade torácica da medula na parte inferior do bloco.
12. Para fatias sagitais, coloque uma linha fina de adesivo de cianoacrilato na plataforma de secção, levante o alargamento lombossacral por uma raiz anexada e coloque o cordão ao longo da linha de cola, garantindo que uma superfície lateral esteja no adesivo e a outra voltada para cima. Coloque-o no banho de corte contendo sacarose gelada aCSF (pasta).
13. Para fatias horizontais, coloque uma linha fina de adesivo de cianoacrilato na plataforma de seccionamento. Levante o aumento lombossacral por uma raiz anexada e coloque o aumento lombossacral ao longo da linha de adesivo, garantindo que a superfície ventral esteja no adesivo e a superfície dorsal voltada para cima. Use raízes presas para posicionar o cabo. Coloque-o no banho de corte contendo sacarose gelada aCSF (pasta).

5. Gravações de matriz de microeletrodos

NOTA: As etapas a seguir detalham como usar dados de registro de experimentos baseados em MEA em fatias da medula espinhal. Vários experimentos MEA podem ser usados dependendo do experimento. Os detalhes do projeto para MEAs usados nesses experimentos são mostrados na Tabela 2 e na Figura 2. Informações detalhadas do projeto foram publicadas por Egert et al. e Thiebaud et al. para MEAs planares e tridimensionais (3D), respectivamente. Ambos os tipos MEA são compostos por 60 eletrodos de nitreto de titânio, com uma camada isolante de nitreto de silício e trilhas de nitreto de titânio e almofadas de contato.

1. Configuração experimental
   1. Ligue o computador e a placa de interface e inicie o software de gravação.
   2. Carregue o modelo de gravação pré-montado (Figura 3A). Nomeie os arquivos do dia na guia do gravador.
   3. Borbulhar continuamente aCSF com carbogênio (5% CO₂, 95% O₂) durante o experimento.
   4. Ligue o sistema de perfusão, que é controlado por uma bomba peristáltica. Colocar a conduta de entrada em um CSF e a extremidade de entrada em um copo de resíduos. Preparar as linhas de perfusão com aCSF.
   5. Prepare 4-AP e quaisquer outras soluções medicamentosas diluindo estoques em 50 mL de aCSF até a concentração final necessária (por exemplo,., 200 μM para 4-AP).
2. Atividade da 4-aminopiridina (4-AP)
   1. Após a incubação, transfira uma única fatia da incubadora usando uma pipeta Pasteur de ponta grande cheia de aCSF.
   2. Coloque a fatia no poço MEA e adicione mais aCSF.
   3. Posicione a fatia sobre a matriz de gravação de 60 eletrodos usando um pincel de cabelo curto fino. Evite entrar em contato com os eletrodos com o pincel ou arrastar o tecido pelos eletrodos, especialmente se estiver usando matrizes 3D.
      nota: Dependendo do layout MEA, isso pode ser feito com ou sem a ajuda de um microscópio para um posicionamento preciso.
   4. Após posicionar a fatia, coloque uma rede pesada sobre o tecido para mantê-lo no lugar e promover um bom contato com os eletrodos MEA.
      nota: A fatia pode precisar de reposicionamento após a colocação da rede.
   5. Coloque o MEA no headstage de gravação (Figura 2A, B).
   6. Verifique a posição do tecido sobre os eletrodos usando um microscópio invertido (ampliação de 2x) para confirmar se o maior número possível de eletrodos está sob o corno dorsal superficial (SDH). Certifique-se de que pelo menos 2-6 eletrodos não entrem em contato com a fatia, pois esses eletrodos são importantes para subtrair o ruído e registrar artefatos durante a análise (Figura 2E).
   7. Ligue a câmera, conecte-a ao dispositivo e tire uma imagem de referência da fatia em relação ao MEA para uso durante a análise.
   8. Pressione Iniciar DAQ (aquisição de dados) no software de gravação e confirme se todos os eletrodos estão recebendo um sinal claro.
      nota: Se o sinal for barulhento, solte o headstage e limpe as almofadas de contato MEA e os contatos de mola dourada com etanol 70% (use um lenço de laboratório para garantir que as almofadas e os contatos estejam secos após a limpeza). Se o sinal ainda estiver ruidoso, desligue os eletrodos com defeito no software de gravação ou anote para exclusão posteriormente durante a análise.
   9. Conecte as linhas de entrada e saída de perfusão ao poço MEA (previamente preenchido com aCSF) e ligue o sistema de perfusão. Verifique a vazão, idealmente 4-6 volumes de banho por minuto, e certifique-se de que a vazão seja suficiente para evitar o transbordamento do superfusato.
   10. Deixe o tecido se equilibrar por 5 minutos e, em seguida, registre 5 minutos de dados de linha de base brutos e não filtrados.
   11. Mova a linha de entrada de perfusão de aCSF para uma solução de 4-AP e aguarde 12 minutos para que a atividade rítmica induzida por 4-AP atinja o estado estacionário (2 minutos para que os medicamentos cheguem ao banho e 10 minutos para que a atividade atinja o pico e depois o platô).
   12. Registre 5 min de atividade induzida por 4-AP. Esteja preparado para gravações subsequentes para testar os medicamentos ou para verificar a estabilidade do 4-AP.

Tabela 1: Composições artificiais do líquido cefalorraquidiano.

Tabela 2: Layouts de arranjo de microeletrodos.

Figura 1: Orientações de corte da medula espinhal, métodos de montagem e corte. (A) As fatias transversais requerem um bloco de corte de isopor com uma ranhura de suporte cortada nele. A medula espinhal é apoiada contra o bloco na ranhura de suporte, o lado dorsal da medula voltado para longe do bloco. O bloco e o cordão são colados em um estágio de corte com adesivo de cianoacrilato. (B) As fatias sagitais são preparadas colocando uma linha fina de adesivo de cianoacrilato no estágio de corte e, em seguida, posicionando a medula espinhal de lado na cola. (C) As fatias horizontais são preparadas colocando uma linha fina de adesivo de cianoacrilato no estágio de corte e, em seguida, posicionando o lado ventral da medula espinhal para baixo na cola.

Figura 2: Posicionamento do tecido no arranjo de microeletrodos. (A) A imagem mostra um headstage MEA aberto com um MEA colocado em posição. (B) O mesmo que A com o headstage MEA fechado para gravações e sistema de perfusão tecidual instalado. (C) A imagem mostra um MEA fornecido pelo fabricante. As almofadas de contato, que fazem interface com as molas douradas do estágio principal, e o banho de tecido MEA que contém a solução de banho de tecido e a fatia de tecido são mostrados. A área destacada pelo quadrado vermelho no centro é a localização do feixe de eletrodos. (D) Os esquemas mostram as duas configurações de eletrodos MEA usadas neste estudo, com mais detalhes apresentados na Tabela 2. O eletrodo de referência é denotado pelo trapézio azul. O layout do eletrodo MEA esquerdo mostra uma configuração quadrada de 60 eletrodos, mais usada nos modelos de trabalho apresentados 60MEA200/30iR-Ti com eletrodos de 30 μm de diâmetro espaçados 200 μm, ou 200 μm espaçados e 100 μm espaçados MEAs tridimensionais (60MEA200/12/50iR-Ti e 60MEA100/12/40iR-Ti) com eletrodos de 12 μm de diâmetro e 50 μm ou 40 μm de altura, respectivamente. O layout do eletrodo MEA esquerdo mostra um layout retangular de 6 x 10 eletrodos-60MEA500/30iR-Ti. (E) Imagem de alta ampliação de um MEA quadrado 60MEA100 / 12 / 40iR-Ti com corte transversal da medula espinhal posicionado para gravação. A fatia fica nas fileiras de eletrodos 3-8. A linha superior de eletrodos, que não entra em contato com nenhum tecido, serve como eletrodos de referência. A área SDH aparece como uma banda semitransparente. Nesse caso, o SDH sobrepõe eletrodos nas linhas 4, 5 e 6 e nas colunas 2, 3, 4, 5 e 7 do MEA. Barra de escala = 200 μm. Abreviaturas: MEA = arranjo de microeletrodos; SDH = corno dorsal superficial.

Figura 3: Layouts de ferramentas de gravação e análise de dados e exemplos de gravações de matriz de microeletrodos mostrando potencial de ação extracelular e formas de onda de potencial de campo local. (A) O esquema mostra o modelo de gravação pré-configurado usado para a aquisição de dados MEA. Vincular o MEA2100 e a ferramenta de gravação (headstage/amplificador) permite que os dados sejam nomeados e salvos. Quatro exemplos de traços de dados brutos (à direita, épocas de 5 minutos) foram coletados por um canal MEA mostrando atividade na linha de base, 12 min após a aplicação de 4-AP, mais 15 minutos após a atividade de 4-AP estabelecida e após a aplicação de banho de TTX (1 μM). Observe que a adição de 4-AP (segundo traço) produz um aumento claro no ruído de fundo e na atividade EAP/LFP. É importante ressaltar que a atividade permanece relativamente estável por pelo menos 15 minutos após o estabelecimento da atividade induzida por 4-AP (terceiro traço). A adição de TTX (1 μM) abole toda a atividade (traço inferior). (B) O esquema (à esquerda) mostra a configuração do software do analisador para análise de dados. A ferramenta exploradora de dados brutos é usada para importar gravações coletadas pelo software de gravação. Esses dados são então executados por meio de uma ferramenta de filtro de canal cruzado que subtrai o(s) sinal(is) do(s) eletrodo(s) de referência selecionado(s) de outros eletrodos para remover o ruído de fundo. Os dados passam pelo filtro EAP e pelas ferramentas de filtro LFP para otimizar as relações sinal-ruído para cada forma de onda. Após esta etapa, os dados do caminho EAP entram na ferramenta detector EAP, onde os limites são definidos. Os EAPs são detectados e enviados para a ferramenta de análise EAP, onde as latências de cada evento são registradas e exportadas como um txt. arquivo. Um fluxo de trabalho idêntico ocorre para dados LFP usando um kit de ferramentas LFP correspondente. Os traços à direita mostram dados de um único canal MEA contendo várias formas de onda extracelulares. A localização dos sinais EAP e LFP é destacada nos 'rasters de contagem' acima. Os traços inferiores são épocas de gravação superior (denotadas por barras vermelhas) mostrando formas de onda em uma escala de tempo expandida, incluindo vários sinais LFP (observe a variedade de aparições) e EAPs extracelulares individuais (círculos vermelhos). Observe que a forma de onda e a polaridade LFP / EAP variam em relação ao número de neurônios que produzem esses sinais, sua proximidade com o eletrodo de registro e sua localização em relação ao (s) eletrodo (s) próximo (s). Abreviaturas: MEA = arranjo de microeletrodos; EAP = potencial de ação extracelular; LFP = potencial de campo local; 4-AP = 4-aminopiridina; TTX = tetrodotoxina.