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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Eletrofisiologia in vitro
- Preparação de soluções para preparação e registro de fatias da medula espinhal
- Líquido cefalorraquidiano artificial
nota: O líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) é usado em uma câmara de incubação de interface, onde as fatias são armazenadas até o início do registro e durante os experimentos como perfusato e diluente para drogas. Consulte a Tabela 1 para a composição detalhada.
- Prepare aCSF contendo (em mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glicose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 e 2,5 CaCl2 adicionando as quantidades necessárias do acima, excluindo CaCl2, a 2 L de água destilada.
- Borbulhar a solução acima com carbogênio (95% O2, 5% CO2) por 5 min e adicionar CaCl2.
nota: Esta etapa evita a precipitação de CaCl2, ou seja, a solução não deve ficar turva. Para aplicação de medicamentos durante experimentos, dilua as soluções estoque de medicamentos em aCSF até as concentrações finais desejadas.
2. Líquido cefalorraquidiano artificial substituído por sacarose
NOTA: O aCSF substituído por sacarose é usado durante a dissecção e o corte da medula espinhal. Como indicado pelo nome, a sacarose é substituída pelo NaCl para reduzir a excitação neuronal durante esses procedimentos, mantendo a osmolaridade. Consulte a Tabela 1 para a composição detalhada.
- Prepare aCSF substituído por sacarose contendo (em mM) 250 sacarose, 25 NaHCO3, 10 glicose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 e 2,5 CaCl2 adicionando as quantidades necessárias de todos os itens acima, excluindo CaCl2, a 300 mL de água destilada.
- Borbulhe a solução com carbogênio por 5 min e adicione CaCl2.
- Conservar a solução num congelador a -80 °C durante cerca de 40 minutos ou até que a solução forme uma pasta. Evite congelar sólidos e use enquanto estiver na consistência de pasta.
3. Preparação da matriz de microeletrodos
NOTA: A superfície de contato do MEA requer um pré-tratamento para torná-lo hidrofílico.
- Antes do experimento, encha o poço MEA com soro fetal bovino (FBS) ou soro de cavalo (HS) por 30 min.
- Remova o FBS ou HS e enxágue bem o MEA com aproximadamente cinco lavagens de água destilada até que a água destilada não fique mais espumosa. Encha o poço com aCSF, pronto para uso.
4. Preparação aguda do corte da medula espinhal
- Anestesie profundamente o camundongo com 100 mg / kg de cetamina (ip) e decapite-o usando uma grande tesoura cirúrgica.
- Remova a pele sobre a região abdominal fazendo um pequeno corte na pele ao nível dos quadris. Puxe a pele de cada lado do corte rostralmente até que toda a pele seja removida, ou seja, do topo da caixa torácica até o topo da pelve (ventral e dorsalmente).
- Coloque o corpo no gelo e use uma abordagem ventral para expor a coluna vertebral, removendo todas as vísceras e cortando as costelas laterais ao esterno.
- Remova a caixa torácica ventral, ambas as escápulas (cortadas em aproximadamente T2) e os membros inferiores e a pelve (cortadas aproximadamente no topo do sacro).
- Transfira a coluna vertebral e a preparação da costela para um banho de dissecação contendo sacarose gelada aCSF. Prenda todos os quatro cantos da preparação (superfície ventral para cima) colocando pinos nos músculos da parte inferior das costas e nas costelas superiores anexadas.
- Remova todo o músculo e tecido conjuntivo que cobre a superfície ventral das vértebras com rongeurs e identifique a região vertebral sobre o alargamento lombossacral, que fica aproximadamente abaixo dos corpos vertebrais T12 a L2.
- Remova um corpo vertebral que é caudal à região de alargamento lombossacral para fornecer acesso à medula espinhal enquanto ela fica no canal vertebral.
- Usando uma tesoura de mola curva, corte os pedículos vertebrais bilateralmente enquanto levanta e puxa o corpo vertebral rostralmente para separar os aspectos ventral e dorsal das vértebras e expor a medula espinhal.
- Uma vez que os corpos vertebrais são removidos para revelar o aumento lombossacral, limpe cuidadosamente as raízes restantes que ancoram a medula espinhal com uma tesoura de mola até que a medula flutue livremente.
- Isole a medula espinhal com cortes rostral e caudal bem acima e abaixo do aumento lombossacral, permitindo que a região-alvo da medula 'flutue livremente'
nota: A orientação de fatia preferida determinará como o cabo é posteriormente montado para seccionamento (Figura 1).
- Para fatias transversais, levante o segmento lombossacral por uma raiz anexada e coloque-o em um bloco de poliestireno (isopor) pré-cortado (1 cm x 1 cm x 1 cm) com um canal raso cortado no centro. Use adesivo de cianoacrilato (consulte a Tabela de Materiais) para prender o bloco e o cabo à plataforma de corte e coloque-o no banho de corte contendo sacarose gelada aCSF (pasta).
nota: O canal raso ajuda a proteger e orientar a medula espinhal, com o lado dorsal exposto e a extremidade torácica da medula na parte inferior do bloco.
- Para fatias sagitais, coloque uma linha fina de adesivo de cianoacrilato na plataforma de secção, levante o alargamento lombossacral por uma raiz anexada e coloque o cordão ao longo da linha de cola, garantindo que uma superfície lateral esteja no adesivo e a outra voltada para cima. Coloque-o no banho de corte contendo sacarose gelada aCSF (pasta).
- Para fatias horizontais, coloque uma linha fina de adesivo de cianoacrilato na plataforma de seccionamento. Levante o aumento lombossacral por uma raiz anexada e coloque o aumento lombossacral ao longo da linha de adesivo, garantindo que a superfície ventral esteja no adesivo e a superfície dorsal voltada para cima. Use raízes presas para posicionar o cabo. Coloque-o no banho de corte contendo sacarose gelada aCSF (pasta).
5. Gravações de matriz de microeletrodos
NOTA: As etapas a seguir detalham como usar dados de registro de experimentos baseados em MEA em fatias da medula espinhal. Vários experimentos MEA podem ser usados dependendo do experimento. Os detalhes do projeto para MEAs usados nesses experimentos são mostrados na Tabela 2 e na Figura 2. Informações detalhadas do projeto foram publicadas por Egert et al. e Thiebaud et al. para MEAs planares e tridimensionais (3D), respectivamente. Ambos os tipos MEA são compostos por 60 eletrodos de nitreto de titânio, com uma camada isolante de nitreto de silício e trilhas de nitreto de titânio e almofadas de contato.
- Configuração experimental
- Ligue o computador e a placa de interface e inicie o software de gravação.
- Carregue o modelo de gravação pré-montado (Figura 3A). Nomeie os arquivos do dia na guia do gravador.
- Borbulhar continuamente aCSF com carbogênio (5% CO2, 95% O2) durante o experimento.
- Ligue o sistema de perfusão, que é controlado por uma bomba peristáltica. Colocar a conduta de entrada em um CSF e a extremidade de entrada em um copo de resíduos. Preparar as linhas de perfusão com aCSF.
- Prepare 4-AP e quaisquer outras soluções medicamentosas diluindo estoques em 50 mL de aCSF até a concentração final necessária (por exemplo,., 200 μM para 4-AP).
- Atividade da 4-aminopiridina (4-AP)
- Após a incubação, transfira uma única fatia da incubadora usando uma pipeta Pasteur de ponta grande cheia de aCSF.
- Coloque a fatia no poço MEA e adicione mais aCSF.
- Posicione a fatia sobre a matriz de gravação de 60 eletrodos usando um pincel de cabelo curto fino. Evite entrar em contato com os eletrodos com o pincel ou arrastar o tecido pelos eletrodos, especialmente se estiver usando matrizes 3D.
nota: Dependendo do layout MEA, isso pode ser feito com ou sem a ajuda de um microscópio para um posicionamento preciso.
- Após posicionar a fatia, coloque uma rede pesada sobre o tecido para mantê-lo no lugar e promover um bom contato com os eletrodos MEA.
nota: A fatia pode precisar de reposicionamento após a colocação da rede.
- Coloque o MEA no headstage de gravação (Figura 2A, B).
- Verifique a posição do tecido sobre os eletrodos usando um microscópio invertido (ampliação de 2x) para confirmar se o maior número possível de eletrodos está sob o corno dorsal superficial (SDH). Certifique-se de que pelo menos 2-6 eletrodos não entrem em contato com a fatia, pois esses eletrodos são importantes para subtrair o ruído e registrar artefatos durante a análise (Figura 2E).
- Ligue a câmera, conecte-a ao dispositivo e tire uma imagem de referência da fatia em relação ao MEA para uso durante a análise.
- Pressione Iniciar DAQ (aquisição de dados) no software de gravação e confirme se todos os eletrodos estão recebendo um sinal claro.
nota: Se o sinal for barulhento, solte o headstage e limpe as almofadas de contato MEA e os contatos de mola dourada com etanol 70% (use um lenço de laboratório para garantir que as almofadas e os contatos estejam secos após a limpeza). Se o sinal ainda estiver ruidoso, desligue os eletrodos com defeito no software de gravação ou anote para exclusão posteriormente durante a análise.
- Conecte as linhas de entrada e saída de perfusão ao poço MEA (previamente preenchido com aCSF) e ligue o sistema de perfusão. Verifique a vazão, idealmente 4-6 volumes de banho por minuto, e certifique-se de que a vazão seja suficiente para evitar o transbordamento do superfusato.
- Deixe o tecido se equilibrar por 5 minutos e, em seguida, registre 5 minutos de dados de linha de base brutos e não filtrados.
- Mova a linha de entrada de perfusão de aCSF para uma solução de 4-AP e aguarde 12 minutos para que a atividade rítmica induzida por 4-AP atinja o estado estacionário (2 minutos para que os medicamentos cheguem ao banho e 10 minutos para que a atividade atinja o pico e depois o platô).
- Registre 5 min de atividade induzida por 4-AP. Esteja preparado para gravações subsequentes para testar os medicamentos ou para verificar a estabilidade do 4-AP.
Tabela 1: Composições artificiais do líquido cefalorraquidiano.
| químico | aCSF (mM) | aCSF (g/100 mL) | aCSF substituído por sacarose (mM) | aCSF substituído por sacarose (g/100 mL) | ACSF com alto teor de potássio (mM) | ACSF com alto teor de potássio (g/100 mL) |
| Cloreto de sódio (NaCl) | 118 | 0,690 | - | - | 118 | 0,690 |
| Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3) | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 |
| glicose | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 |
| Cloreto de potássio (KCl) | 2.5 | 0,019 | 2.5 | 0,019 | 4.5 | 0,034 |
| Di-hidrogenofosfato de sódio (NaH2PO4) | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | 2.5 | 0,028 | 2.5 | 0,028 | 2.5 | 0,028 |
| sacarose | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tabela 2: Layouts de arranjo de microeletrodos.
| Layouts de matriz de microeletrodos |
| Modelo de matriz de microeletrodos | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Planar ou tridimensional (3D) | Planar | 3d | 3d | Planar |
| Grade de eletrodos | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
| Espaçamento entre eletrodos | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Diâmetro do eletrodo | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Altura do eletrodo (3D) | N/A | 40 μm | 50 μm | N/A |
| Experiências | Corte transversal | Corte transversal | Sagital + Horizontal | Sagital + Horizontal |
