Registro de alterações na atividade nervosa simpática renal em resposta à pressão arterial em ratos

Resumo

Fonte: Fink, A. M., et al. Quantificando Alterações Agudas na Atividade do Nervo Simpático Renal em Resposta a Manipulações do Sistema Nervoso Central em Ratos Anestesiados. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica de estudo da atividade dos nervos simpáticos renais (RSNs) em resposta a mudanças na pressão arterial em ratos. Ao conectar um cateter sensor de pressão à artéria femoral, os nervos simpáticos renais são expostos. Os nervos são então levantados para um eletrodo de registro e sua atividade elétrica é registrada. Em seguida, uma droga vasoconstritora é injetada para elevar a pressão arterial e as alterações correspondentes na atividade do RSN são monitoradas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Criar eletrodos RSNA bipolares

1. Para criar o eletrodo, corte dois pedaços de fio de aço inoxidável cada um com aproximadamente 18 mm de comprimento. Corte um pedaço de tubo de polietileno (PE-50) com aproximadamente 15 mm de comprimento. Passe os dois pedaços de fio na tubulação, deixando o fio saliente de ambas as extremidades.
2. Remova o isolamento das extremidades dos fios; apare os fios deixando 2-3 mm de fio exposto. Em uma extremidade, prenda os pinos macho sobre o fio exposto. Solde os pinos firmemente ao fio, prenda os pinos dentro de uma tira de conectores e cubra a conexão com epóxi.
   nota: Uma abordagem alternativa que evita a soldagem é usar clipes jacaré de conexão / liberação rápida.
3. Na extremidade oposta do eletrodo, remova o isolamento das extremidades dos fios, deixando 2-3 mm de fio exposto. Dobre esta parte dos fios para criar pequenos ganchos em forma de "V" no fio não isolado.
   nota: Esta é a porção do eletrodo que estará em contato com o nervo simpático renal. É importante vedar esta extremidade para evitar que fluidos entrem na tubulação. Silicone ou epóxi podem ser usados efetivamente.

2. Administrar anestesia e preparar locais cirúrgicos

1. Administre anestesia a um rato Sprague Dawley macho (9-11 semanas de idade, pesando 150-400 g). Administre pentobarbital sódico 50 mg / kg por meio de uma injeção intraperitoneal (IP). Para avaliar um plano estável de anestesia durante a cirurgia, verifique o reflexo de pinça do dedo do pé a cada 15 minutos e retome a dose da anestesia conforme necessário.
   nota: O pentobarbital sódico (Nembutal) foi usado em estudos anteriores para atingir um plano sustentado de anestesia sem interferir na modulação da ANRS. Este protocolo é para cirurgia de não sobrevivência, portanto, não há período de recuperação/monitoramento pós-operatório.
2. Prepare o local da cirurgia de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados com os animais (ou seja, raspe o abdômen, as costas e a cabeça do rato; limpe a pele com solução de iodopovidona a 10%; aplique lubrificante para os olhos; e coloque o rato em uma almofada de aquecimento). Manter a temperatura corporal a 37 °C durante as experiências.

3. Canular a artéria femoral para monitoramento da pressão arterial média

1. Visualize a artéria sob o microscópio. Semelhante ao método usado para canulação venosa, amarre a sutura distal para ocluir a artéria; Prenda as bordas dessa sutura ao campo cirúrgico com fita de seda e posicione a artéria perpendicularmente à mão dominante do cirurgião.
2. Acesso arterial se estiver usando telemetria
   1. Inspecione o cateter sensor de pressão sob alta ampliação antes da canulação arterial. Certifique-se de que o cateter esteja livre de bolhas/detritos e tenha um menisco intacto entre os componentes cheios de líquido (proximal) e preenchidos com gel (distais). Antes de cada implante, reabasteça o gel na ponta distal do cateter. Ligue o transmissor usando um ímã; monitorar a pressão arterial (PA) durante a cirurgia para suportar o posicionamento perfeito.
   2. Use um meio nó solto na sutura proximal para ocluir brevemente a artéria femoral. Segure o introdutor do cateter com a mão não dominante. Segure a ponta da cânula da unidade de telemetria com uma pinça de canulação do vaso para evitar o deslocamento do gel da ponta.
   3. Faça um orifício na artéria com a agulha 22G dobrada e insira a cânula na artéria usando uma pinça de canulação do vaso para evitar o deslocamento do gel da ponta. Avance a cânula o máximo possível. Usando os laços de sutura proximal e distal, prenda o cateter de pressão.
   4. Coloque o corpo do implante de telemetria dentro do flanco adjacente à incisão e feche esta incisão usando sutura de náilon 4-0 em uma agulha cortante. Desligue os dispositivos de telemetria por ímã na conclusão do período de gravação para conservar a vida útil da bateria.

4. Posicione o rato na estrutura da cirurgia estereotáxica para acessar o cérebro

1. Mova suavemente o rato para a posição de bruços no quadro de cirurgia estereotáxica.
2. Posicione o rato entre as barras auriculares e ajuste a barra incisiva para equalizar a altura de lambda e bregma. O posicionamento pode depender da cepa do rato, peso e localização dos alvos do sistema nervoso central (SNC).
3. Faça uma incisão de bisturi rostrocaudal de 2 cm na linha média do couro cabeludo. Usando aplicadores com ponta de algodão, remova firmemente o tecido conjuntivo da superfície do crânio. Aplique peróxido de hidrogênio no crânio para auxiliar na visualização das suturas de bregma, lambda e linha média.
4. Usando um atlas do cérebro do rato para orientar o direcionamento, faça uma osteotomia com orifício de rebarba, dimensionada para acesso ao eletrodo, através do crânio.

5. Isolamento dos nervos simpáticos renais

1. Conecte o eletrodo RSNA do fio (Etapas 1.1-1.3) a um pré-amplificador 10X e microeletrodo amplificador.
2. Isole os nervos renais através de uma incisão retroperitoneal antes ou depois de o rato ser preso na estrutura estereotáxica. Posicione os eletrodos RSNA assim que o rato estiver no quadro estereotáxico. Faça uma incisão de bisturi estendendo-se de 4 a 5 cm abaixo das costelas na direção caudal, ligeiramente lateral à coluna. Blunt disseca a incisão para visualizar os músculos paraespinhais.
3. Use uma tesoura para fazer uma incisão rostrocaudal muito superficial de 1-2 cm, onde a gordura encontra o músculo. Usando aplicadores com ponta de algodão, espalhe a gordura para longe do músculo para visualizar o rim. É importante não entrar no espaço peritoneal.
4. Use afastadores para separar suavemente o rim dos músculos paraespinhais para visualizar a artéria renal e a aorta abdominal. Não estique os vasos excessivamente para evitar danos aos nervos renais. Use uma gaze de algodão de 2" x 2" embebida em solução salina para proteger o rim de lesões.
5. Sob alta ampliação, identifique os nervos renais na bolsa de incisão. Os feixes nervosos são mais facilmente visíveis no ângulo reto formado pela aorta e pela artéria renal. Os nervos renais seguem de perto a artéria renal da aorta até os rins.
6. Selecione um segmento do feixe nervoso que será colocado no eletrodo de gravação. Disseque suavemente as fibras nervosas do tecido/vaso circundante usando uma pinça de microdissecação.
7. Prenda o eletrodo RSNA do fio em um suporte (por exemplo, um clipe jacaré preso a um suporte de suporte). Abaixe o eletrodo até o nível do segmento nervoso. Use um gancho nervoso para levantar suavemente o segmento do nervo renal sobre o eletrodo sem esticar o nervo.
   nota: O nervo deve repousar dentro de ambos os ganchos em forma de "V" no fio não isolado, paralelo ao nervo. Os fios do eletrodo não devem tocar em nenhum outro tecido, sangue ou fluido linfático.
8. Preencha a incisão com óleo mineral para evitar que o nervo simpático renal exposto fique seco. Use um clipe de aterramento com uma extremidade na pele da incisão e a outra presa à gaiola de Faraday.
9. Direcione o sinal para os amplificadores usando filtragem passa-alta e passa-baixa (10 Hz e 3 kHz). Ajuste o ganho até 10 K. Inclua um monitor de áudio para avaliar o padrão de ruptura do RSNA. Use taxas de amostragem variando entre 2.000 e 10.000 Hz. Use uma taxa de amostragem aumentada quando houver hipótese de que uma manipulação do SNC cause respostas simpáticas rápidas/breves.

6. Dados de registro

1. Avalie a qualidade do registro do RSNA evocando o barorreflexo com uma injeção em bolus de 1 mL de solução salina ou 10 μg/mL de fenilefrina (em 0,1 mL) por via intravenosa. Conforme ilustrado na Figura 1, a infusão deve aumentar a PA e inibir a ANRS. Um aumento na pressão arterial média de 60-80 mmHg é suficiente para a inibição da simpatoinização renal.
2. Ajuste a posição dos eletrodos para melhorar o sinal, se necessário. O reposicionamento é necessário se o nervo não estiver em contato com os dois ganchos do eletrodo ou se algum tecido, sangue ou fluido linfático estiver em contato com os fios.
   nota: A necessidade de reposicionamento é baseada nas características auditivas das descargas nervosas.
3. Assim que um sinal claro for obtido, prenda o eletrodo RSNA no lugar retirando o óleo mineral e aplicando um gel de sílica para cobrir a conexão nervo/eletrodo na bolsa de incisão. Não mova o rato antes que o gel esteja completamente endurecido.
4. Execute protocolos de manipulação do SNC enquanto registra continuamente a RSNA e a pressão arterial média. Se um microinjetor/pulsador for usado para manipulações do tronco cerebral, um sinal lógico deste dispositivo pode ser introduzido nas gravações RSNA/BP para documentar o tempo das manipulações do SNC.
5. Quando o experimento estiver concluído, determine o nível de ruído esmagando o nervo proximal aos eletrodos de registro entre o gel de sílica e o músculo espinhal. Registre pelo menos 30 s desse valor "zero" para RSNA. Como uma abordagem alternativa para quantificar o ruído, administre um bloqueador ganglionar de ação curta, como atropina, hexametônio, clorisondamina ou tartarato de pentolínio.
6. Remova cuidadosamente o eletrodo RSNA e remova quaisquer vestígios de gel de sílica dos eletrodos de fio. Guarde o eletrodo para reutilização. Desligue o transmissor de telemetria e remova-o, tomando cuidado para não danificar a ponta do cateter.

Resultados

Figura 1: RSNA e BP em resposta à injeção de fenilefrina IV.O RSNA bruto (A) foi retificado de onda completa (B); RSNA "zero" triturado retificado é mostrado na inserção C. Foram calculadas médias de 10 s não sobrepostas (menos ruído) (D). Para evocar o barorreflexo, 0,1 mL de fenilefrina (1 μg/mL) foi injetado por via intravenosa (n...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fio de aço inoxidável	Sistemas AM; Sequim, WA	Nº 791000	Eletrodo RSNA
Tubulação de polietileno (PE-50)	VWR; Radnor, Pensilvânia	Nº 63019-048	Eletrodo RSNA; canulação do vaso
Conector de pino miniatura	Sistemas AM; Sequim, WA	Rolamento 520200	Eletrodo RSNA
Ferramenta de crimpagem	Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, Flórida	M22520	Eletrodo RSNA
Régua de conectores	Amfenol; Município de Clinton, MI	Telefone: 221-2653	Eletrodo RSNA
Epóxi JB Kwik	J-B Weld, Molas de Enxofre, TX	Rolamento 8270	Eletrodo RSNA
silicone	Permatex; Hartford, CT	2222	Eletrodo RSNA
Heparina sódica; Injetável (frasco de 10 mL, 1000 U/mL)	KV Suprimentos Veterinários; Cidade de David, NE	Pág. 03466	Perviedade da linha venosa
Fenilefrina HCl; Injetável (frasco para injetáveis de 1 mL; 10 mg/mL)	Suprimentos Cirúrgicos ACE; Brockton, MA	Rolamento 950-6312	Teste da simpatoinibição renal
Suportes cirúrgicos elásticos de gancho único	Aparelho de Harvard; Holliston, MA	Telefone: 72-2595	incisão
Fita cirúrgica de seda	3M, Minneapolis, MN	1538-0	Estadias cirúrgicas seguras
Agulhas, 20 g	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	Z192554-100EA	Canulação do vaso
Pinça curva Dumont #7	Ferramentas de Belas Ciências; Cidade Foster, Califórnia	11274-20	Canulação do vaso
5-0 laços de sutura de seda	Braintree Científico; Braintree, MA	SUT-S 106	Canulação do vaso
Pinça hemostática delicada	Fornecedor:Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD	RS-7117	Canulação do vaso e cirurgia de ANSR
Pinça hemostática Crile	Ferramentas de Belas Ciências; Cidade Foster, Califórnia	13004-14	Flexão de agulha
Transmissor de telemetria	Ciências de Dados Internacionais; Minneapolis, MN	PA-10	Monitorização da pressão arterial média (telemetria)
Seringa Re-gel	Ciências de Dados Internacionais; Minneapolis, MN	Telefone: 276-0038-001	Reutilização do transmissor (telemetria)
Transdutor de pressão descartável	Transpac; San Clemente, Califórnia	MI-1224	Monitorização da pressão arterial média
Infusor de pressão Clear-Cuff	MILA International Inc.; Florença, KY	2281339	Monitorização da pressão arterial média
Pinça de canulação de vasos	Ferramentas de Belas Ciências; Cidade Foster, Califórnia	00574-11	Inserção do cateter
Sutura de nylon monofilamento preto 4-0 na agulha de corte reverso	McKesson Médico-Cirúrgica; São Francisco, Califórnia	S661GX	Transmissor de telemetria seguro
Receptor de telemetria	Ciências de Dados Internacionais; Minneapolis, MN	RPC-1	Monitorização da pressão arterial média (telemetria)
LabChart Pro (software), PowerLab (hardware de aquisição)	Instrumentos AD; Colorado Springs, CO	ML846, matriz MX2 2.0 (compatível com telemetria Data Science International)	3 opções de software/hardware de aquisição
SciWorks (software), DataWave (hardware de aquisição)	DataWave Technologies, Loveland, CO	N/A
Spike 2 (software), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., Londres, Reino Unido	1401-3
Micro-broca	Fornecedor:Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD	RS-6300	Cirurgia do SNC
Quadro para cirurgia estereotáxica	Stoelting; Wood Dale, IL	Rolamento 51600	Cirurgia do SNC
Amplificador de microeletrodo com pré-amplificador 10X	Sistemas AM; Sequim, WA	1800-2	Gravação RSNA
Retractores	Ferramentas de Belas Ciências; Cidade Foster, Califórnia	17009-07	Gravação RSNA
Pinças de microdissecação	Ferramentas de Belas Ciências; Cidade Foster, Califórnia	11251-10	Gravação RSNA
Micro-gancho	Ferramentas de Belas Ciências; Cidade Foster, Califórnia	10064-14	Gravação RSNA
Óleo mineral	Fisher Científico; Waltham, MA	8042-47-5	Gravação RSNA
Monitor de áudio	Sistemas AM; Sequim, WA	3300	Gravação RSNA
Gel de sílica	Wacker, München; Alemanha	RT601A-B	Gravação RSNA
Clipes elétricos	Tyco Eletrônica; Schaffhausen, Suíça	EB0283-000	Aterramento ou fixação da agulha de perfusão
Tesoura de bonn, pontas retas/afiadas	Roboz Instrumento Cirúrgico Co; Gaithersburg, MD	RS-5840	perfusão
Agulha de gavagem	Aparelho de Harvard; Holliston, MA	Pedido 75-0286	perfusão
Bomba de perfusão Masterflex	Cole-Parmer; Vernon Hills, IL	7524-10	perfusão
Tubo de silicone curado com platina Masterflex	Cole-Parmer; Vernon Hills, IL	Rolamento 96410-15	perfusão
Formalina (solução tamponada a 10%; 4 L)	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	HT501128	perfusão
sacarose	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	S0389	Crioproteção