Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Gravações de patch-clamp de célula inteira
- Transferir a primeira secção de tecido para a câmara de registo submersa num fluxo contínuo de solução de Krebs. Monte a seção usando pesos leves e mergulhe a objetiva.
- Identifique a região estriatal no microscópio e procure neurônios positivos para GFP (reprogramados). Selecione um neurônio que seja extenso em morfologia e não coberto por feixes de fibras ou vasos sanguíneos.
- Prepare pipetas de vidro borossilicato (3–7 MΩ) para remendo e encha com a seguinte solução intracelular (em mM): 122,5 gluconato de potássio, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3 Na3GTP e 8 NaCl, ajustado para pH 7,3 com KOH.
- Conecte a pipeta de vidro ao eletrodo de registro e mergulhe-a na solução. Verifique novamente a resistência do eletrodo. Em seguida, aproxime-se lentamente da célula com a pipeta, mantendo uma leve pressão positiva no eletrodo para evitar entupir a ponta.
CUIDADO: Tenha cuidado para acompanhar sua célula enquanto desce o eletrodo e não branquear a fluorescência na célula (ou seja, desligue a lâmpada de fluorescência quando não precisar dela).
- Enxágue o tecido circundante cuidadosamente usando pressão positiva do eletrodo e aproxime-se da célula com o eletrodo. Localize o eletrodo bem no topo da célula e desça até que o eletrodo toque a membrana. Faça uma vedação Giga-Ω entre o eletrodo e a membrana celular e, com pulsos de pressão negativa, rompa a membrana para criar um adesivo de célula inteira.
CUIDADO: Os neurônios reprogramados são sensíveis. Tenha cuidado ao remendar e não coloque muita pressão negativa ao alcançar um selo Giga-Ω ou abrir a membrana celular. Além disso, remendar animais mais velhos requer prática e paciência, pois seu tecido conjuntivo é mais espesso e é mais difícil visualizar os neurônios.
- Verifique os potenciais de membrana em repouso imediatamente após a quebra no modo de pinça de corrente e anote-os para análise.
- No clamp de corrente, manter a célula entre -60 mV a -80 mV e injetar correntes de 500 ms de -20 pA a +90 pA, com incrementos de 10 pA para induzir potenciais de ação.
