Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparando o animal para imagens
- Coloque gaze estéril, cotonetes e ferramentas cirúrgicas autoclavadas na área de cirurgia. Ligue um esterilizador de microesferas para esterilização intercirúrgica de ferramentas cirúrgicas.
- Anestesiar o camundongo (macho ou fêmea, 1,5 a 2,5 meses, 20 a 25 g) por injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (17,2 mg / mL), xilazina (0,475 mg / mL) e acepromazina (0,238 mg / mL) (6 μL / g de peso corporal). Espere até que a profundidade adequada da anestesia seja atingida quando o animal deixar de responder a um estímulo de pinça do dedo do pé e não tiver reflexo da córnea. Durante a cirurgia, administre uma dose de reforço de 1/3 da dose original do coquetel anestésico, conforme necessário para manter o estado anestésico original.
- Injete buprenorfina por via subcutânea (s.c.; 0,05–0,10 mg/kg) como agente analgésico antes da cirurgia. Aplique pomada protetora nos olhos do animal para evitar o ressecamento da córnea e a formação de catarata.
- Coloque um camundongo transgênico GCaMP6s em uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia e cubra-o com uma cortina cirúrgica estéril. Estabilize a cabeça do animal com um adaptador de fixação de cabeça para ratos.
- Raspe a cabeça sobre a maior parte do couro cabeludo com uma lâmina de barbear de dois gumes. Limpe a área cirúrgica com uma almofada de preparação de álcool estéril, seguida de uma solução de iodopovidona.
2. Preparação da Janela Craniana Crônica
- Faça um corte retangular do couro cabeludo (2 mm x 3 mm) com uma tesoura em um lado (direito) do crânio. Empurre a pele para o lado com um cotonete para criar uma área de exposição de >3 mm de diâmetro (Figura 1A). Remova o tecido conjuntivo preso ao crânio raspando suavemente o crânio com uma lâmina microcirúrgica romba (Lâmina de bisturi # 10; Figura 1C).
- Marque a área S1 desenhando suavemente um círculo (3 mm de diâmetro, coordenação central: -1,5 mm do bregma e 2,5 mm da linha média) no crânio usando uma broca odontológica (Figura 2B).
- Realize o mesmo procedimento no crânio esquerdo (Figura 2B).
- Aplique uma fina camada de Super Cola de Cianoacrilato no osso para fornecer uma base para a aplicação do cimento dentário.
- Sob um microscópio de dissecação, dilua um sulco circular no crânio ao redor da área S1 usando uma microbroca de alta velocidade (Figura 1D). O objetivo é criar uma borda lisa para a colocação de uma janela óptica sobre ele.
- Aplique repetidamente líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF, temperatura ambiente) no crânio periodicamente durante o processo de afinamento para facilitar a perfuração e dissipar o calor. Execute a perfuração intermitentemente para evitar superaquecimento induzido por atrito. Sugue os detritos ósseos com uma linha de vácuo doméstica ou uma bomba de vácuo.
- Após aproximadamente 2/3 da profundidade do osso ser perfurado, lenta e cuidadosamente afinar o 1/3 do osso restante até que um pedaço circular do crânio (retalho ósseo) esteja completamente livre do crânio circundante.
- Remova lenta e cuidadosamente o retalho ósseo circular com um par de pinças # 5/45 e exponha a dura-máter (Figura 2C; Figura 1E).
- Mantenha a região cerebral exposta úmida com ACSF (Figura 1E). Evite qualquer dano aos vasos piais, pois a hemorragia alterará o fluxo sanguíneo cerebral, acelerará o inchaço cerebral e degradará gravemente a qualidade da imagem.
- Execute o mesmo procedimento no lado esquerdo (contralateral) do crânio.
- Para montar a janela óptica, use adesivo óptico para colar e curar entre as camadas de lamínula, uma de cada vez. Se necessário, aqueça a janela óptica (50 °C por 12 h) em uma incubadora para melhorar a colagem adesiva. A janela óptica contém 2 partes: a parte superior contém uma única tampa de vidro redonda com um diâmetro de 5 mm e a parte inferior contém 1–3 vidro de cobertura redondo com um diâmetro de 3 mm (Figura 2D).
- Armazene a janela óptica em etanol (70%, vol/vol) e lave-a com solução salina estéril antes de usar. Antes da instalação da janela óptica, verifique se há imperfeições na janela óptica, incluindo uma quantidade incorreta de adesivo óptico ou alinhamento impreciso sob um estereoscópio.
- Instale a janela óptica sobre a região da craniotomia (Figura 2D). A parte superior da janela óptica repousa sobre o crânio, e a parte inferior da janela óptica se encaixa dentro da abertura craniotomizada e repousa sobre a dura-máter na presença de LCR (Figura 2D, E).
- Sele a parte superior da borda da janela óptica no crânio com a Super Cola de Cianoacrilato (Figura 2F; Figura 1F).
- Quando a Super Cola de Cianoacrilato secar, aplique cimento dental preto (Dentsply) para cobrir a borda do vidro. Aplique cimento dental em todas as margens expostas do crânio e da ferida para bloquear a luz (Figura 2G-H; Figura 1B).
- Execute o mesmo procedimento no lado esquerdo.
- Permita que o animal se recupere na almofada de aquecimento e devolva o animal à sua gaiola de origem para recuperação sob monitoramento adequado. Forneça alimentos úmidos para facilitar a mastigação e a hidratação. Para reduzir a dor, administre buprenorfina s.c. (0,05–2,0 mg/kg) a cada 8–12 h após a lesão por 2 dias. Deixe o mouse se recuperar por mais 7 a 10 dias antes de fazer a imagem.
