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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Implante de eletrodo VEP
- Anestesiar o animal com injeção intraperitoneal de cetamina (75 mg/kg) e medetomidina (0,5 mg/kg).
nota: Após a indução anestésica, observe os reflexos de retirada (teste de pinça, reflexo corneano e palpebral, etc.) e sua ausência como indicação para iniciar a cirurgia. Monitore continuamente os animais durante a cirurgia e administre medicamentos anestésicos adicionais (10% da dose inicial de cetamina por recarga) se os reflexos estiverem presentes. Ratos adultos (>12 semanas) são usados nos experimentos.
- Depile a pele da área cirúrgica. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento (37 °C) para manter a temperatura corporal durante a cirurgia. Prepare a pele através da aplicação tópica de iodopovidona. Aplique drapeados cirúrgicos. Aplique pomada oftálmica tópica para evitar o ressecamento da córnea sob anestesia geral. Mantenha a assepsia usando instrumentos estéreis.
- Faça uma incisão longitudinal na linha média da pele da cabeça. Limpe o tecido conjuntivo para obter uma boa exposição do crânio.
- Faça pequenos furos manualmente usando uma micro furadeira manual a 7 mm atrás do bregma e 3 mm lateral à linha média.
- Implante eletrodos de parafuso através do crânio até o córtex (área 17), penetrando no córtex a uma profundidade de aproximadamente 0,5 mm. Implante um eletrodo de parafuso de referência na linha média de 3 mm rostral ao bregma. Aplique cimento dentário para envolver e fixar os parafusos (nem sempre necessário).
- Suture a pele da cabeça, administre pomada antibiótica na pele e permita que o animal se recupere da anestesia em uma almofada de aquecimento.
Nota: Alternativamente, os eletrodos podem ser deixados expostos para que a pele não precise ser reaberta em cada gravação. Imediatamente após a interrupção da cirurgia, mas antes da recuperação anestésica, administre um anti-inflamatório não esteróide (AINE) (se não for administrado no pré-operatório) ou um analgésico opioide. Monitore os animais constantemente até que eles se recuperem totalmente do anestésico e sejam ambulatórios.
- Aguarde pelo menos 1 semana para que os animais se recuperem da cirurgia antes do registro do VEP.
2. Gravação VEP
- Anestesiar o animal e preparar a pele como 1.1 e 1.2.
Nota: Uma dose menor de anestésicos pode ser usada para registro eletrofisiológico (cetamina 40 mg/kg e medetomidina 0,25 mg/kg).
- Coloque o rato em um quarto escuro e deixe-o se adaptar à escuridão por 5 a 30 minutos. Em alguns casos, os ratos podem ser O/N adaptados ao escuro para gravações escotópicas ou adaptadas à luz para gravações de VEP fotópicas.
- Manter a temperatura corporal a 37 ± 0,5 °C pelo sistema de manta homeotérmica com uma sonda de termómetro rectal.
- Dilate as pupilas com colírio de tropicamida a 1,0%. Abra a pele sobre o crânio para acessar os eletrodos de parafuso in situ pré-colocados.
- Conecte o parafuso sobre o córtex visual contralateral do olho estimulado e o parafuso de referência ao amplificador. Insira um eletrodo de agulha na cauda como o solo. Meça e mantenha a impedância do eletrodo abaixo de 5 kΩ.
- Coloque um estimulador mini-Ganzfeld diretamente na pele ao redor das pálpebras para fornecer isolamento ocular superior. A iluminação do estimulador precisa ser calibrada previamente por um fotômetro.
- Forneça estimulação fótica por meio de flashes de luz 100 vezes a uma frequência de 1 Hz, com configurações de filtro passa-banda baixa e alta de 1 e 100 Hz, respectivamente. A taxa de amostragem do sinal é de 5 kHz.
Nota: Os sinais devem ser amostrados pelo menos a cerca de 250 - 300 Hz para garantir que mais de duas amostras sejam coletadas durante cada ciclo.
- Suture a pele para trás e mantenha os animais em uma almofada de aquecimento para se recuperar da anestesia. O registro pode ser gravado repetidamente em animais individuais para monitorar as alterações funcionais durante um período de tempo.