Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de tubos, eletrodos e instrumentos para o procedimento cirúrgico
- Use os seguintes instrumentos microcirúrgicos: tesoura cirúrgica, microtesoura angular, pinça de tecido, um par de micropinças curvas Dumont #7 e #5, um porta-microagulha e afastadores.
nota: Este é um procedimento agudo, portanto, os instrumentos não precisam ser esterilizados. Após o uso, limpe e limpe as pontas com etanol 70%.
- Mergulhe o tubo em etanol a 70% e, em seguida, lave-o com NaCl estéril a 0,9% com heparina 100 U / mL antes de usar. Deixe a tubulação cheia para evitar a introdução de bolhas de ar no sistema.
- Corte um pedaço de tubo de polietileno (PE)-50 de 20-30 cm para fazer um cateter para a medição da pressão intracavernosa (PIC). Certifique-se de que a tubulação seja a mais curta possível para reduzir o damppressão da pressão.
- Dobre uma agulha 24G estéril de um lado para o outro até que a agulha se quebre no meio. Conecte a peça com o chanfro à extremidade distal do tubo de PE para inserção na cruz peniana. Insira a outra metade no cubo para conexão ao transdutor de pressão. Encha o sistema com solução salina heparinizada (100 U/mL).
- Para fazer o eletrodo bipolar revestido de Teflon, corte dois fios de prata de 125 μm no mesmo comprimento. Use um pedaço de fita adesiva para prender os fios na borda da mesa e encadeie-os. Em seguida, conecte o eletrodo a uma placa preta.
- Faça uma pequena incisão no Teflon e use uma micropinça # 5 para retirar um comprimento de 4-5 mm de revestimento de Teflon das pontas dos eletrodos. Corte as pontas com um bisturi para obter um comprimento uniforme e crie ganchos dobrando as pontas ao redor da borda cega de uma lâmina de bisturi.
- Prenda o eletrodo com fita adesiva com a extremidade ligeiramente estendida sobre a borda da placa preta com os ganchos apontando para cima. Misture a cola de silicone em uma placa de plástico por 10 s e enrole uma bolha de cola ao redor do eletrodo a 1-2 mm do gancho.
- Deixe secar por aproximadamente 5 min antes de usar (Figura 1). Retire o Teflon de uma seção mais longa na outra extremidade para permitir a conexão com o estimulador.
nota: Ao refazer os ganchos na extremidade distal, o eletrodo pode ser reutilizado várias vezes.
2. Preparação do animal
- Depois de anestesiar o animal, raspe a metade inferior do abdômen, pescoço e períneo. Esfregue o animal com álcool 70% seguido de iodopovidona três vezes. Coloque o rato em uma almofada cirúrgica aquecida em decúbito dorsal. Aplique pomada veterinária e mude a anestesia para um cone nasal com isoflurano a 2,5% e oxigênio 0,8 L/min como transportador.
nota: Ajuste o nível de isoflurano e oxigênio para atingir um nível aceitável de anestesia.
3. Preparação pré-cirúrgica
- Realize todo o procedimento cirúrgico sob um microscópio cirúrgico: uma ampliação variando de 3,15X a 20X é suficiente. Use luvas e mantenha um ambiente limpo durante toda a cirurgia. Coloque o rato em uma cortina.
4. Dissecção do músculo isquiocavernoso para a medição da PIC
- Use um bisturi, uma tesoura reta e uma micropinça curva Dumont #7 para fazer uma incisão vertical na pele de 1 cm 5 mm lateral à linha média, começando no nível da base do pênis e estendendo-se para baixo (Figura 2A). Use um cotonete e separe cuidadosamente a fáscia lateral ao escroto (Figura 2B). Após dissecar a fáscia, colocar afastadores e palpar com uma troca com ponta de algodão para encontrar a tuberosidade isquiática (Figura 2C).
- Dissecar através do tecido adiposo medial deste ponto até que o músculo isquiocavernoso seja visualizado (Figura 3A). Use um par de micropinças curvas Dumont #7 e separe longitudinalmente o músculo. A túnica albugínea aparecerá como uma estrutura branca brilhante (Figura 3B). Usando microfórceps e uma microtesoura, exponha a túnica albugínea adequadamente para ver seu curso (Figura 3C).
- Após a calibração das configurações do sistema, insira o tubo através da pele no períneo, certificando-se de que ele corra paralelo à crus peniana (Figura 4). Deixe a linha no lugar e mantenha a incisão úmida com solução salina.
5. Dissecção do NC para Estimulação
- Faça uma incisão abdominal na linha média 2 cm mais baixa através da pele usando primeiro um bisturi e depois uma tesoura reta e uma micropinça. Crie uma incisão correspondente através da fáscia ao longo da linha alba e do tecido muscular subjacente para expor a bexiga e a próstata.
- Use afastadores para obter uma boa exposição. Use cotonetes para separar a próstata do tecido adiposo para obter uma visualização clara do gânglio pélvico principal (MPG) e do nervo cavernoso (NC), correndo na face dorsolateral da próstata (Figura 5).
- Após a visualização do GPM e do NC, incisão cuidadosa da fáscia que recobre o nervo 2-5 mm distal ao GPM com microtesoura angulada (Figura 6a). Com o uso de uma micropinça # 5, espalhe o tecido em cada lado do nervo e embaixo dele para liberar uma porção de 4 mm de comprimento (Figura 6b) e deslize uma sutura 9-0 sob o nervo (Figura 6c).
- Eleve ligeiramente o nervo com a ajuda da sutura (Figura 7a) para facilitar a colocação dos ganchos do eletrodo bipolar ao redor do nervo (Figura 7b). Deixe um assistente misturar a cola de silicone de dois componentes com a ponta de uma agulha de insulina por 5 s. Seque o nervo e aplique a cola na área ao redor dos ganchos e do nervo (Figura 7c, d). Mantenha o nervo elevado puxando levemente o eletrodo por aproximadamente 1 min para permitir que a cola seque.
- Remova os retractores, exceto os retratores do lado direito, para evitar qualquer puxão ou torção do eletrodo. Molhe os órgãos expostos com solução salina e coloque gaze embebida em solução salina sobre a incisão.
6. Canulação do corpo cavernoso para a medição da PIC
- Restaurar a visualização da túnica albugínea com afastadores. Certifique-se de não prender os afastadores ao músculo isquiocavernoso, pois isso distorcerá a crus.
- Colocar a agulha e lavar o tubo com solução salina heparinizada antes de introduzi-lo na túnica albugínea. Mantenha a túnica albugínea esticada, usando a micropinça curva Dumont #7 em uma mão (não dominante), segurando a túnica albugínea e o restante do músculo sobrejacente distal ao ponto de inserção. Segure a agulha com micropinça reta na outra mão dominante e introduza-a paralelamente ao trajeto do corpo cavernoso (Figura 8).
- Empurre a agulha 5-8 mm para dentro do corpo cavernoso. Lave o tubo e pressione o crus para testar a linha (Figura 9). Certifique-se de que não haja vazamentos. Prenda o tubo à mesa com fita adesiva para evitar puxões acidentais na linha. Remova os retratores.
7. Estimulação do NC
- Ao executar o programa de gravação (por exemplo, Pico 2), registre continuamente a pressão arterial intracavernosa e média.
- Defina os seguintes parâmetros em um estimulador (por exemplo, SD9 Grass Instruments, consulte a Tabela de Materiais) para estimulação CN: corrente a 1.5 mA, frequência a 16 Hz, tensão a 3 V e largura de pulso a 5 ms. Aplique 50 s de estimulação com um mínimo de 1 min de descanso entre as estimulações.
nota: Os primeiros estímulos geralmente resultam em uma resposta diminuída (Figura 10).
