Registro de grampo de remendo de célula inteira em um neurônio da substância gelatinosa de uma fatia da medula espinhal

Resumo

Fonte: Zhu, M., et al. Preparação de fatias agudas da medula espinhal para registro de patch-clamp de células inteiras em neurônios da substância gelatinosa. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o procedimento para realizar registros eletrofisiológicos em neurônios da substância gelatinosa (SG) de fatias da medula espinhal, usando técnicas de patch-clamp de células inteiras para analisar os padrões de disparo dos neurônios. Este método permite o estudo das respostas neurais a estímulos em neurônios SG da medula espinhal.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada.

1. Preparação de Soluções e Materiais

1. Soluções
   1. Prepare o líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) (em mM): 117 cloreto de sódio (NaCl), 3,6 cloreto de potássio (KCl), 1,2 dihidrogenofosfato de sódio di-hidratado (NaH₂PO₄·2H₂O), 2,5 cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl₂·2H₂O), 1,2 cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl₂·6H₂O), 25 bicarbonato de sódio (NaHCO₃), 11 D-glicose, 0,4 ácido ascórbico, e 2 piruvato de sódio. Veja a Tabela 1.
   2. Prepare a solução intracelular à base de K⁺ (em mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 Na 2-fosfocreatina, 0,5 etilenoglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N',N'-tetracético (EGTA), ácido 10 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), 4 trifosfato de adenosina de magnésio (Mg-ATP) e 0,3 trifosfato de guanosina de lítio (Li-GTP). Veja a Tabela 2.
   3. Prepare solução intracelular à base de césio (Cs⁺) (em mM): 92 sulfonato de césio metano (CsMeSO₄), 43 cloreto de césio (CsCl), 10 Na 2-fosfocreatina, 5 tetraetilamônio (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP e 0,3 Li-GTP. Veja a Tabela 3.
      nota: Todas as soluções devem ser preparadas com água destilada. O ACSF e a sacarose-ACSF devem ser carbogenados (mistura de 95% de O₂ e 5% de CO₂) antes do uso para manter um pH ideal de aproximadamente 7,4, e a osmolalidade dessas duas soluções deve ser ajustada para 300–310 miliosmoles (mOsm). Como o ácido ascórbico pode afetar os canais de cálcio, esse agente deve ser omitido se alguém quiser registrar as correntes de cálcio. A osmolalidade e o pH das soluções intracelulares devem ser medidos e ajustados para 290–300 mOsm e 7,2–7,3, respectivamente. Recomenda-se filtrar as soluções intracelulares com filtros de 0,2 μm e armazenar as soluções como alíquotas de 1 mL a -20 °C. Cs⁺ e TEA são aplicados em solução intracelular à base de Cs⁺ para bloquear o canal de potássio, o que é propício ao uso do amplificador para manter o potencial de membrana estável em 0 mV ao registrar correntes pós-sinápticas inibitórias (IPSCs).
2. Instrumentos
   1. Para um sistema eletrofisiológico típico, use um microscópio vertical equipado com contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) e uma objetiva de imersão em água de alta resolução, uma câmera CCD/CMOS, um amplificador patch-clamp, um suporte de micropipeta e um micromanipulador que permita o ajuste fino da posição da pipeta. Um estágio XY também é necessário para mover o microscópio.
   2. Monte todos os equipamentos em uma mesa de isolamento de vibração cercada por uma gaiola de Faraday. Conecte um monitor de vídeo à câmera de vídeo para observar os neurônios e visualizar as micropipetas.
3. Micropipetas
   1. Faça eletrodos de gravação de capilares de vidro borossilicato usando um extrator de micropipeta. A resistência típica da pipeta varia de 3-6 MΩ quando preenchida com solução intracelular.

2. Gravações de patch-clamp de célula inteira

1. Para conduzir os registros de patch-clamp de células inteiras de neurônios da substância gelatinosa (SG), use solução intracelular baseada em K ⁺ para a maioria dos casos de registro, enquanto aplica a solução baseada em Cs ⁺ apenas para o registro de correntes pós-sinápticas inibitórias.
2. Mova suavemente uma fatia da medula espinhal para a câmara de gravação e, em seguida, mantenha-a com um fio de platina em forma de U preso com fios de náilon firmemente para uma estabilidade ideal da fatia. Perfunda constantemente a fatia com ACSF borbulhado em RT através de um sistema de gravidade e defina a taxa de perfusão em 2–4 mL/min para obter oxigenação suficiente.
3. Identifique a região de SG (uma banda translúcida) usando uma lente de microscópio de baixa resolução, escolha um neurônio saudável usando a objetiva de alta resolução como célula-alvo e ajuste-a para o centro da tela do monitor de vídeo.
4. Encha uma micropipeta com um volume apropriado de solução intracelular à base de K⁺ ou Cs⁺, conforme necessário, insira a micropipeta no porta-eletrodo e certifique-se de que a solução intracelular entre em contato com o fio de prata dentro do suporte.
5. Coloque a micropipeta em foco, mergulhe-a no ACSF usando um micromanipulador e, em seguida, aplique uma leve pressão positiva (~ 1 psi quando medido com um manômetro) para forçar a micropipeta a se afastar de qualquer sujeira e detritos.
6. Mova a micropipeta em direção ao neurônio alvo gradualmente. Libere a pressão positiva assim que a pipeta se aproximar do neurônio e uma covinha muito pequena se forma na membrana neuronal para formar um gigaseal.
7. Altere o potencial de retenção para -70 mV, que está próximo do potencial fisiológico de membrana em repouso (RMP) de uma célula. Em seguida, aplique uma sucção transitória e suave à micropipeta para romper a membrana e criar uma boa configuração de célula inteira.
   nota: Depois de transferir a fatia para a câmara de gravação, certifique-se de uma perfusão constante por pelo menos 5 minutos para limpar os detritos na superfície da fatia. Vale a pena notar que a capacidade de distinguir entre neurônios saudáveis e não saudáveis / mortos é de suma importância para um bom selamento e registro estável. Um neurônio insalubre / morto tem uma aparência inchada ou encolhida, juntamente com um grande núcleo visível, enquanto um neurônio saudável é caracterizado por uma forma tridimensional (3D) com uma membrana brilhante e lisa, e seu núcleo é invisível. Para obter uma configuração de célula inteira, é essencial compensar a capacitância rápida ou lenta passo a passo quando necessário. À temperatura ambiente (RT), o potencial de junção líquida é calculado em 15,1–15,2 milivolts (mV) e 4,3–4,4 mV em soluções intracelulares baseadas em K⁺ e Cs⁺, respectivamente. Em nossos estudos, os dados registrados não foram corrigidos para o potencial de junção líquida.
8. Registros de propriedades intrínsecas da membrana
   1. Registre as propriedades de disparo: Teste o padrão de disparo de cada neurônio no grampo de corrente com uma série de pulsos de corrente despolarizante de 1 s (25–150 picoamperes (pA) com incremento de 25 pA) em RMP. Meça o limite, a amplitude e a meia largura de um único potencial de ação offline.

Tabela 1: Receita para ACSF

componente	peso molecular	Concentração (mM)	g/L
NaCl	58,5	117	6,84
Kcl	74,5	3.6	0,27
NaH2PO4·2H2O	156	1.2	0,19
CaCl2·2H2O	147	2.5	0,37
MgCl2·6H2O	203	1.2	0,24
NaHCO3	84	25	2.1
D-glicose	180	11	1,98
ácido ascórbico	198.11	0,4	0,08
Piruvato de sódio	110	algarismo	0,22

Tabela 2: Receita para solução intracelular baseada em K⁺

componente	peso molecular	Concentração (mM)	mg/100 mL
K-gluconato	234,2	130	3044.6
Kcl	74,5	5	37.28
Na2-fosfocreatina	453,38	10	453,38
EGTA	380,35	0,5	19.02
HEPES	238,31	10	238,3
Mg-ATP	507,18	4	202,9
Li-GTP	523,18	0,3	15.7

Tabela 3: Receita para solução intracelular baseada em Cs⁺

componente	peso molecular	Concentração (mM)	mg/100 mL
CsMeSO4	228	92	2097.6
CsCl	168,36	43	723,95
Na2-fosfocreatina	453,38	10	453,38
CHÁ-CL	165,71	5	82,86
EGTA	380,35	0,5	19.02
HEPES	238,31	10	238,3
Mg-ATP	507,18	4	202,9
Li-GTP	523,18	0,3	15.7

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaCl	sigma	S7653	Usado para a preparação de ACSF e PBS
Kcl	sigma	Nº 60130	Usado para a preparação de ACSF, sacarose-ACSF e solução intracelular à base de K+
NaH2PO4·2H2O	sigma	Rolamento 71500	Usado para a preparação de ACSF, sacarose-ACSF e PBS
CaCl2·2H2O	sigma	C5080	Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
MgCl2·6H2O	sigma	M2670	Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
NaHCO3	sigma	S5761	Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
D-glicose	sigma	G7021	Usado para a preparação de ACSF
ácido ascórbico	sigma	Pág. 5280	Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
Piruvato de sódio	sigma	A7631	Usado para a preparação de ACSF e sacarose-ACSF
sacarose	sigma	S7903	Usado para a preparação de sacarose-ACSF
K-gluconato	Wako	169-11835	Usado para a preparação de solução intracelular à base de K+
Na2-fosfocreatina	sigma	Pág. 1937	Usado para a preparação de solução intracelular
EGTA	sigma	E3889	Usado para a preparação de solução intracelular
HEPES	sigma	H4034	Usado para a preparação de solução intracelular
Mg-ATP	sigma	Resposta A9187	Usado para a preparação de solução intracelular
Li-GTP	sigma	G5884	Usado para a preparação de solução intracelular
CsMeSO4	sigma	C1426	Usado para a preparação de solução intracelular à base de Cs+
CsCl	sigma	C3011	Usado para a preparação de solução intracelular à base de Cs+
CHÁ-CL	sigma	T2265	Usado para a preparação de solução intracelular à base de Cs+
Na2HPO4	Reagentes químicos Hengxing		Usado para a preparação de PBS
Capilares de vidro borossilicato	Instrumentos de precisão mundiais	TW150F-4	1,5 mm de diâmetro externo, 1,12 mm de diâmetro interno
Extrator de micropipetas	Instrumento Sutter	Pág. 97	Usado para a preparação de micropipetas
Câmera CCD infravermelha	Dage-MIT	IR-1000
Amplificador de fixação de remendo	HEKA	EPC-10
Micromanipulador	Instrumento Sutter	MP-285
Estágio XY	Burleigh	GIBRALTAR X-Y
Microscópio vertical	Olimpo	BX51WI
Osmômetro	avançado	FISKE 210
Medidor de PH	Mettler Toledo	FE20