Registrando a atividade elétrica cerebral em camundongos que se comportam usando sondas de silício linear de haste múltipla

Resumo

Fonte: Sauer, J., et al. Registrando oscilações espacialmente restritas no hipocampo de camundongos em comportamento. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve um protocolo para implantar uma sonda de silício linear de várias hastes no cérebro do camundongo para medir os potenciais de campo local. O procedimento envolve prender a sonda a uma unidade estereotáxica, posicioná-la com precisão sobre a região alvo do cérebro, inseri-la no cérebro e prendê-la com cimento dentário. Após a implantação, o conjunto é protegido com um invólucro. Após a recuperação, a configuração permite registrar potenciais de campo locais, fornecendo informações sobre a atividade neuronal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparativos

1. Projete e construa uma ferramenta de inserção apropriada transportando transitoriamente a sonda de silício e o conector do eletrodo durante o processo de implantação. Consulte a Figura 1 para obter um exemplo de ferramenta de inserção personalizada.
2. Solte cuidadosamente a sonda de silicone e o conector do eletrodo de sua embalagem usando uma pinça com ponta de cerâmica.
3. Levante a placa do conector e fixe-a firmemente com um grampo de crocodilo preso a um suporte.
4. Usando um estereoscópio, alinhe a sonda com a ferramenta de inserção com uma pinça com ponta de cerâmica. Aplique uma camada de ~ 2 mm de cera de parafina derretida com um cauterizador para colar a sonda na ferramenta de inserção. Tome cuidado para não tocar nas hastes da sonda durante este procedimento.
5. Fixe o conector do eletrodo ao eixo da ferramenta de inserção usando fita adesiva padrão. Observe que, dependendo do fabricante, os fios terra podem precisar ser soldados à placa do conector do eletrodo antes da implantação. Remova o isolamento de dois pedaços curtos de fio de cobre isolado com verniz usando solda de estanho aplicada com um ferro de solda (400 °C). Solde os fios terra nos slots apropriados na placa do conector do eletrodo.
6. Remova o isolamento de dois pedaços adicionais de fio de cobre. Enrole cada fio de cobre desencapado três vezes em torno de um parafuso de aço inoxidável (1 mm de diâmetro, 2 mm de comprimento). Aplique fluxo adequado para soldar aço e solde o fio de cobre na parte inferior da tampa de rosca. Certifique-se de que a metade inferior da rosca do parafuso permaneça livre de solda de estanho.
7. Use um multímetro padrão para verificar o contato elétrico entre o fio e o parafuso.
8. Desinfete as hastes da sonda de silicone e os parafusos de aterramento por imersão em etanol a 70% (10 s).
9. Prepare uma capa protetora para o implante da sonda cortando a cabeça de uma pipeta de plástico Pasteur ao meio.

2. Cirurgia de Implantação

1. Esterilize os instrumentos cirúrgicos (tesouras, pinças de ponta fina, pinças cirúrgicas) com um esterilizador de esferas quentes. Limpe todas as superfícies com etanol 70%.
2. Induza a anestesia com isoflurano a 3% em oxigênio administrado a ~ 1 L / min.
   1. Para manutenção, use 1 - 1,5% de isoflurano. Observe que a concentração de isoflurano necessária para atingir a tolerância cirúrgica pode variar de animal para animal.
   2. A tolerância cirúrgica estável é alcançada quando o animal não responde ao beliscão do dedo do pé. Monitore a frequência respiratória do camundongo e ajuste a concentração de isoflurano, se necessário.
   3. Aplique pomada nos olhos do animal para evitar o ressecamento.
3. Monte o mouse em uma estrutura estereotáxica inserindo suavemente as barras auriculares no canal auditivo. Uma vez que a cabeça do mouse esteja estabilizada pelas barras auriculares, coloque um bocal sobre o focinho para administração contínua de isoflurano. Coloque o mouse sobre uma toalha ou almofada sobre uma almofada de aquecimento e injete buprenorfina por via subcutânea (0,05 - 0,1 mg / kg de peso corporal) para garantir a analgesia pós-operatória.
4. Raspe a cabeça com um barbeador padrão e desinfete a pele com etanol 70%. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão na pele ao longo da linha média do crânio e abra a pele usando pinças cirúrgicas.
5. Alinhe a cabeça do animal com o auxílio de uma ferramenta de alinhamento estereotáxico para nivelar bregma e lambda. Deve haver menos de 50 μm de deslocamento de altura entre bregma e lambda. Além disso, nivele a cabeça ao longo do eixo mediolateral medindo a profundidade do bregma na superfície do crânio em distâncias definidas à esquerda e à direita (por exemplo, 1 mm à esquerda e à direita do bregma). Ajuste a inclinação da cabeça, se necessário.
6. Limpe a cabeça com água oxigenada a 3% e seque com lenços de algodão estéreis.
7. Determine a localização da craniotomia em relação ao bregma usando um atlas estereotáxico apropriado.
8. Usando uma cabeça de broca de 0,9 mm, faça dois orifícios de parafuso no osso sobre o cerebelo para colocar os parafusos de aterramento e de referência. Além disso, 1 a 3 furos para parafusos de ancoragem são desejáveis para estabilizar o implante. A localização dos parafusos de ancoragem dependerá da localização da craniotomia. Para implantação no hipocampo, coloque parafusos de ancoragem sobre o córtex parietal contralateral e frontal ipsilateral. Insira os parafusos no osso usando uma chave de fenda adequada. Tome cuidado para não penetrar no cérebro.
9. Realize a craniotomia afinando lentamente o crânio com a broca em uma área retangular ao redor do lado da implantação. Umedeça frequentemente o osso com tampão fosfato esterilizado (PB). O crânio afinado restante pode ser suavemente perfurado e removido com o auxílio de uma agulha de injeção fina (27G) e uma pinça.
10. Perfure cuidadosamente a dura-máter com uma agulha de injeção fina (27G). Forme um pequeno gancho dobrando a ponta da agulha com uma pinça e puxe a dura-máter para remoção. Aplique PB para evitar que a superfície do cérebro seque.
11. Monte a ferramenta de inserção do eletrodo em um suporte estereotáxico, zere a sonda no bregma e mova a sonda para as coordenadas estereotáxicas sobre a craniotomia. Penetre lentamente na superfície do cérebro. Certifique-se de que os eixos da sonda não dobrem. Evite implantar através dos vasos sanguíneos.
12. Abaixe lentamente a sonda até ~200 μm acima da profundidade desejada. Cubra a craniotomia e as hastes da sonda de silicone com vaselina esterilizada para proteção. Aplique cimento dentário para fixar a base da sonda ao parafuso de ancoragem no crânio.
13. Logo após a aplicação do cimento, mova lentamente a sonda até a profundidade desejada. O avanço dos últimos ~200 μm após a aplicação do cimento reduz o movimento lateral da sonda e garante danos mínimos ao tecido na área-alvo. Observe que o tempo de cura do cimento utilizado pode afetar esta etapa do protocolo. Com cimento de cura rápida, omita esta etapa e implante diretamente a sonda na profundidade desejada para evitar danos à sonda de silicone.
14. Após a cura do cimento, solte a sonda da ferramenta de inserção derretendo a cera com um cauterizador.
15. Solte a placa do conector do dispositivo de inserção e posicione-a em um local adequado no crânio usando um crocodilo clamp preso à alça de inserção. Em caso de implantação da sonda no hipocampo, coloque a placa conectora no osso parietal contralateral. Fixe a placa do conector ao crânio usando cimento dental.
16. Solde os fios terra e de referência da placa do conector aos fios presos aos dois parafusos sobre o cerebelo.
17. Apare a tampa protetora na altura correta e coloque-a sobre a sonda de silicone. Fixe a tampa na placa do conector e no crânio usando cimento dental, evitando a pele ao redor do crânio exposto. A sutura da pele ao redor do local de implantação geralmente não é necessária.

3. Recuperação após a cirurgia

1. Aplicar tratamento analgésico adequado durante pelo menos 2 dias (por exemplo, injeções subcutâneas de buprenorfina a cada 6 h durante o dia e na água de bebida durante a noite combinada com carprofeno (4 - 5 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea a cada 24 h). Recomenda-se um único invólucro para evitar danos ao implante.
2. Aguarde pelo menos uma semana para recuperação. Consulte as diretrizes locais de bem-estar animal.

4. Aquisição de dados

1. Registre LFPs de mouses em movimento livre usando um sistema de aquisição de dados adequado conectado por meio de um comutador. Para adquirir LFPs, use uma frequência de amostragem de 1 a 5 kHz. Taxas de amostragem mais altas (20 - 30 kHz) são necessárias para que as descargas de uma única unidade sejam registradas junto com o LFP.
2. Armazene arquivos de gravação brutos dos canais individuais para análise offline.

Resultados

Figura 1: Imagem da ferramenta de inserção. A sonda de silicone é presa a um pino de inseto colado à base de uma braçadeira de crocodilo. O eixo do suporte pode ser inserido em um micro manipulador estereotáxico para implantação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Grampo de crocodilo com suporte	Reichelt Elektronik	CABRESTO ZD-10D
Sonda de silício	Cambridge Neurotech	Série P 32
Estereoscópio	Olimpo	SZ51
Fio de cobre isolado com verniz	Bürklin Elektronik	89 F 232
Parafusos de aterramento	Parafusos e Mais GmbH (screwsandmore.de)	RUÍDO 84 A2 M1x2
fluxo	Stannol	114018
Pinça com ponta cerâmica	Ferramentas de Belas Ciências	11210-60
Cera de Parafina	Sigma-Aldrich	327204
Cauterizador	Ferramentas de Belas Ciências	18010-00
Ferro de solda	Kurtz Ersa	OIC1300
etanol	Carl Roth	Rolamento 9065.1
Pipetas Pasteur	Carl Roth	EA65.1
Esterilizador térmico	Ferramentas de Belas Ciências	18000-45
Quadro estereotáxico	David Kopf	Modelo 1900
Porta-eletrodo estereotáxico	David Kopf	Modelo 1900
Isoflurano	Abbvie	B506
Concentrador de oxigênio	Respironix	1020007
Buprenorfina	Indivior Reino Unido Limitada
Máquina de barbear elétrica	Tondeo	Eco-XS
Almofada de aquecimento	Thermolux	463265/-67
Pinças cirúrgicas	Ferramentas de Belas Ciências	18050-28
Peróxido de hidrogénio	Sigma-Aldrich	H1009
Toalhetes de algodão estéreis	Carl Roth	EH12.1
broca	Proxxon	Micromot 230/E
agulha de injeção 21G	B. Braun	4657527
Tampão fosfato/tampão fosfato salino
Atlas estereotáxico	Elsevier	9.78E+12
Tesoura cirúrgica	Ferramentas de Belas Ciências	14094-11
Pinça cirúrgica	Ferramentas de Belas Ciências	11272-40
Agulhas de injeção 27G	B. Braun	4657705
Vaselina
Cimento dentário	Sol Médico	SuperBond T&M
Carprofeno	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Amplificador de gravação	Intan Technologies	C3323
Placa de aquisição USB	Intan Technologies	C3004
Cabos de gravação	Intan Technologies	C3216
Comutador elétrico	Lentes dóricas	HRJ-OE_FC_12_HARW