Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação da Solução Experimental
- Prepare a solução de dissecação 1 dia a 1 semana antes do experimento real. Use uma solução tampão de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) para dissecção da retina devido à sua forte capacidade de tamponamento em temperaturas mais baixas16. Misture todos os produtos químicos da seguinte forma (em mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glicose. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Mantenha a solução na geladeira por até 1 semana.
- A solução de gravação é o meio de Ames, que é um líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) projetado para preparações retinianas. No dia do experimento, pesar o pó de Ames (4,4 g para solução de 500 ml) em um tubo. Além disso, pesar NaHCO3 (0,95 g para 500 ml de solução) e misturar com o pó de Ames.
- Prepare a solução de pipeta intracelular para registros de patch clamp no dia do experimento. Misture todos os produtos químicos da seguinte forma (em mM): 111 K-gluconato, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 ácido etilenoglicol tetracético (EGTA), 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 ATP-Mg e 1,0 GTP-Na. Ajuste o pH para 7,2 com KOH. Filtre a solução da pipeta com um filtro de seringa convencional. Faça alíquotas de ~ 500 μl e guarde-as em um freezer ou freezer.
2. Preparação para o Dia da Experiência
- Na noite anterior ao experimento, coloque um camundongo em uma gaiola (C57BL / 6J ou fundo semelhante, 4 a 8 semanas de idade, macho) em um espaço escuro para adaptação escura durante a noite (O / N).
- Preparação para dissecação:
- Encha a solução de dissecação (100 - 200 ml) em um copo de vidro, coloque-a no gelo e borbulhe com oxigênio por pelo menos 10 min.
- Inicie a oxigenação da caixa escura para armazenamento da preparação da retina.
- Prepare lamínulas de plástico com trilhos de graxa para preparações de fatias de retina e coloque cada uma delas em um prato de plástico de 35 mm.
- Anexe uma nova lâmina de barbear a um picador (cortador de tecido).
- Corte uma membrana de filtro em duas metades. Isso é para fatiamento de retina.
- Alinhe as ferramentas de dissecação e as pipetas de transferência perto do microscópio de dissecação. A área de trabalho deve ser bem organizada para que cada ferramenta possa ser facilmente acessada no escuro.
- Preparação para gravações de patch clamp:
- Dissolva o pó de Ames e o NaHCO3 em água destilada (Ames 4,4 g e NaHCO3 0,95 g/500 ml ddH2O). Borbulhe o meio de Ames com oxigênio misto (95% O2 e 5% CO2) por pelo menos 30 min enquanto aquece a um nível de temperatura de registro (~ 35 ° C). Ajuste o pH para 7,4 com NaHCO3 enquanto ainda borbulha.
- Descongele a solução de pipeta interna durante a dissecção. Depois de descongelado, adicione 0,01% de sulforrodamina B para coloração intracelular.
3. Gravações de grampo de remendo da preparação de fatias de retina
- Preparação da gravação:
- Prepare os tubos de perfusão com meio de Ames. Deixe todas as bolhas passarem ao encher o tubo.
- Faça pipetas de registro de patch clamp com um extrator. Para encher uma pipeta com a solução de pipeta, mergulhe na parte de trás de uma pipeta por 1 min até que a ponta da pipeta seja preenchida. Em seguida, encha ~ 1/3 da pipeta usando um enchimento de micropipeta. Armazene cada pipeta em uma caixa de pipeta úmida.
- Ligue o equipamento para gravações de patch clamp, incluindo o computador, amplificador, câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) e microscópio.
- Desligue a luz da sala. Coloque uma preparação de corte de retina na câmara de platina do microscópio usando um visualizador infravermelho. Depois de imobilizado, inicie a perfusão contínua. Regular a temperatura de perfusão entre 33 e 37 °C.
- View a superfície da fatia com a câmera CCD. Concentre-se no local de destino onde residem os tipos de célula de destino. Selecione uma célula de aparência saudável para gravação de patch clamp (ou seja, deve ter uma superfície de aparência lisa e um bom formato de célula).
- Coloque uma pipeta de gravação em um suporte de pipeta. Avance a pipeta para a preparação da fatia. Quando estiver perto da preparação da fatia (~2 mm acima), encontre a ponta da pipeta com o microscópio. Quando a ponta da pipeta estiver visível ao microscópio, mova-a para baixo em direção à célula-alvo.
- Defina o amplificador. Ajuste a pipeta a 0 mV/0 pA (zeragem) e inicie um pulso elétrico contínuo de ~5 mV a ~10 Hz. Verifique a resistência da pipeta; a resistência ideal é entre 5 e 10 MΩ para a maioria dos neurônios da retina.
- Comece a soprar a partir da ponta. Use um bocal ou uma seringa para aplicar pressão positiva quando a pipeta mergulhar na solução do banho. Sopre continuamente a solução interna até que a ponta esteja na superfície da célula-alvo.
- Quando a pressão positiva fizer uma pequena covinha na superfície da célula, avance ligeiramente a ponta e pare de soprar. Verifique a resistência da pipeta, que deve aumentar. Se estiver aumentando continuamente, deixe-o e monitore a resistência até atingir >1 GΩ (gigaseal). Se a resistência não aumentar espontaneamente, aplique suavemente pressão negativa até que se torne um gigaseal.
- Depois que o gigaseal for alcançado, altere o potencial de retenção para -70 mV. Em seguida, aplique pressão negativa intermitentemente para romper a membrana dentro da ponta da pipeta. Quando a configuração de toda a célula é feita, a resistência da pipeta pode estar entre 500 MΩ e 1 GΩ, e a corrente capacitiva é vista. Às vezes, correntes pós-sinápticas espontâneas podem ser observadas.
- Registre a relação corrente-tensão (IV) de -80 a +40 mV. Diferentes tipos de canais dependentes de tensão são ativados dependendo do tipo de célula.
- Registre correntes ou tensões sinápticas evocadas por luz.
