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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Implante cirúrgico de arranjos de eletrocorticografia mole (ECoG)
- anestesia
- Pré-medicação: Isole as fêmeas de miniporcos de Göttingen (n = 7) aos 2-6 meses de idade (5-8 kg) e jejue durante a noite. Injete uma mistura de midazolam a 0,75 mg / kg, atropina a 0,25 μg / kg e haldol a 0,1 mg / kg por via intradérmica e espere até que o animal esteja sedado. Pese o animal antes de prosseguir.
- Instalação de eletrodo intravenoso (IV):
- Coloque o animal na mesa de cirurgia em uma almofada de aquecimento. Induza a anestesia colocando uma máscara facial no animal, usando sevoflurano a 3% -3,5%.
- Coloque eletrodos de eletrocardiograma no abdômen, um sensor de saturação sanguínea na cauda e um sensor de temperatura na narina.
- Coloque um eletrodo intravenoso em uma veia da orelha e confirme o acesso ao sangue usando uma seringa cheia de solução salina. Certifique-se de que os olhos sejam mantidos hidratados usando pomada.
- Intubação: Injete um bolus de atracúrio a 0,5 mg / kg, cetamina a 1 mg / kg e fentanil a 1-2 μg / kg. Coloque o animal de costas para intubação. Insira um tubo de 4.5 mm.
- Medicação: Após a intubação, interrompa a anestesia com sevoflurano e instale uma infusão de propofol a 10 mg/kg/h, fentanil a 2 μg/kg/h, atracúrio a 0,2-0,5 mg/kg/h e solução salina a 4-7 mg/kg/h. Inicie uma infusão de manitol a 1 g/kg/h para reduzir o edema cerebral durante a cirurgia.
NOTA: Um regime de analgesia multimodal pode ser usado se recomendado pelo comitê de ética animal local.
- Campo asséptico e preparação da pele: Raspe toda a superfície da cabeça além do campo cirúrgico. Usando uma almofada estéril, esfregue bem a cabeça com betadine. Em seguida, coloque campos estéreis na mesa de instrumentação e no animal para revelar apenas a janela cirúrgica. Por fim, esfregue a cabeça novamente com uma almofada estéril usando betadine.
- Craniotomia e durotomia
- Corte da pele: Incise a pele com uma faca de bisturi ao longo da linha média. Separe o músculo e o periósteo (25 mm lateralmente do bregma em ambos os lados e 40 mm anterior e posterior ao bregma) do osso usando um raspador e coloque espalhadores para obter um acesso ideal para perfuração posterior.
- Medidas e marcação: Identifique bregma e lambda e marque-os com uma caneta cirúrgica estéril (Figura 1A, B). Usando uma régua estéril, defina o contorno do retalho ósseo centralizado em torno do alvo de implantação em ambos os hemisférios. Neste caso específico, optou-se pelo córtex auditivo, com coordenadas -5 mm a -15 mm do bregma e -4 mm a -20 mm lateralmente. Em seguida, ajuste a craniotomia ao tamanho do implante e aos pontos anatômicos, limitando o tamanho da abertura.
- craniotomia:
- Usando uma broca óssea com uma broca de corte redonda, perfure o contorno da craniotomia, levando em consideração a espessura do crânio. Irrigue o local de perfuração com solução salina para evitar o superaquecimento do osso.
- Perfure cuidadosamente o contorno de forma homogênea até atingir a dura-máter. Na primeira descoberta, termine de perfurar o contorno até que ele tenha ficado mais fino o suficiente para quase romper. Em seguida, use uma espátula plana (na linha média ou no lado lateral) para quebrar o retalho ósseo inteiro, usando a borda da craniotomia como alavanca. Se muita resistência for encontrada, continue afinando o osso.
- Coloque a peça de osso em solução salina estéril.
- Depois que o retalho ósseo for removido, retire cuidadosamente a borda da craniotomia, usando um Kerison para evitar que a borda óssea afiada corte a dura-máter.
- Se for encontrado sangramento excessivo na dura-máter ou no osso, use Gelfoam ou cera óssea, respectivamente. Coloque uma compressa úmida (almofada padrão em solução salina estéril) na craniotomia e repita esta etapa no outro hemisfério (Figura 1B).
- Durotomia:
- Usando a agulha de um kit de sutura 6-0, perfure e levante cuidadosamente a dura-máter na extremidade anterior ou posterior da craniotomia a meio caminho entre o lado medial e lateral e crie o início de uma incisão com a facada.
- Em seguida, usando uma pequena espátula plana inserida no espaço subdural atuando como uma base de corte para proteger o córtex, crie uma fenda ântero-posterior na dura-máter avançando simultaneamente com as duas ferramentas. Certifique-se de que a fenda seja ligeiramente maior que a largura do implante (Figura 1C). Se ocorrer algum sangramento ou dano nesta etapa, cubra-o com espuma de gel e espere até que pare.
NOTA: A trajetória da fenda deve ser adaptada se grandes vasos sanguíneos estiverem presentes na dura-máter para evitar sangramento.
- implantação
- Inserção do dispositivo:
- Irrigue o implante (Figura 2A) com solução salina em ambos os lados para que ele deslize para o espaço subdural com mais facilidade. Coloque o implante acima da fenda da dura-máter e, com uma pequena pinça, insira o dispositivo por subdurência deslizando-o sequencialmente em cada borda.
- Segure cuidadosamente a extremidade do pedestal do dispositivo e avance com o implante para não criar tensão que impeça a inserção. Quando a borda do conector estiver localizada na parte superior da fenda, pare a inserção.
- Prenda o implante: Para prender o implante no lugar, coloque uma ponte de titânio sobre o cabo após a borda da craniotomia ou nas asas de ancoragem e prenda-a com um ou dois parafusos de titânio usando a chave de fenda apropriada (Figura 1D).
- Colocação do solo: Remova cuidadosamente 1 cm do isolamento dos fios terra e insira-o periduralmente na extremidade posterior da craniotomia (ou em qualquer local epidural longe do córtex de interesse ou grandes vasos sanguíneos) (fio na Figura 1E)
- Repita os passos no hemisfério contralateral.
- Fechamento da dura-máter: Suture a dura-máter cuidadosamente ao redor do cabo do implante usando uma sutura reabsorvível 3-0 e um pequeno porta-agulha. Junte as duas bordas da dura-máter o máximo possível sem rasgar a membrana fina com o fio de sutura (Figura 1D, E).
- Colocação do retalho ósseo: Fixe uma ponte de titânio na parte anterior e posterior de cada retalho ósseo usando um parafuso de titânio. Tenha o cuidado de planear o posicionamento das pontes em Ti no que diz respeito à colocação das pernas da plataforma de pé nos passos seguintes. Aparafuse a extremidade das pontes de titânio ao crânio (Figura 1F, G).
- Colocação de pedestal e placa de pé
- Posicionamento: Nesta configuração, a placa de pé tem seis pernas com dois orifícios para parafusos cada (Figura 2B). Planeje a colocação da platina no crânio para otimizar a localização dos parafusos (evite colocá-los na borda da craniotomia ou no músculo temporal). Pule os orifícios nas pernas se eles não puderem ser aparafusados.
- Fixação da placa de pé: Aparafuse os parafusos de titânio da placa de pé até que esteja firmemente no lugar (consulte a Figura 1H).
- Colocação do pedestal: Remova as pontes de titânio sobre os cabos de conexão e vire o pedestal para pousar na placa de pé. Aparafuse o pedestal na placa de pé. Verifique se o pedestal está firmemente encaixado (Figura 1I).
- Sutura e fechamento
- Limpeza da ferida: Limpe o espaço subcutâneo de qualquer osso ou outros detritos lavando com solução salina. Corte um pouco de pele ao redor das bordas do pedestal para criar uma borda redonda seguindo o cilindro.
- Suturas subcutâneas: Remova os espalhadores e dobre os retalhos cutâneos. Crie suturas subcutâneas com fio de sutura 4-0 não reabsorvível, com 3 mm de distância, usando suturas simples interrompidas ou suturas simples contínuas. Comece longe do pedestal, movendo-se em direção a ele em ambos os lados da incisão.
- Suturas dérmicas: Suturar a pele com fio de sutura 6-0 não reabsorvível, com suturas separadas por 5 mm. Comece longe do pedestal, movendo-se em direção a ele em ambos os lados da incisão. Tome cuidado para obter uma boa aposição do tecido entre os dois retalhos cutâneos e próximo à borda do pedestal para evitar um vazio (Figura 1J).
- Curativo para feridas: Limpe a área da ferida novamente com uma almofada estéril e betadine. Aplique um curativo estéril autoadesivo sobre a ferida.
- Despertar: Depois que todas as medições forem realizadas, retire o animal de todos os anestésicos, mas mantenha-o sob ventilação. Para analgesia, aplique um adesivo de buprenorfina (25 mg/h) por 24 h. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento coberta com cortinas para acelerar o tempo de despertar. Quando a respiração espontânea for recuperada, extubar o animal e colocá-lo sob uma máscara facial de oxigênio até que a consciência seja recuperada (o que pode levar de 1 a 4 h).
- Cuidados pós-operatórios com animais: Por 5 dias, mantenha o animal sob vigilância rigorosa. Dê uma dose de cefalexina de 75 mg duas vezes ao dia com alimentos, separados dos outros animais. Realize a desinfecção da ferida diariamente aplicando grandes quantidades de betadine com almofadas estéreis embebidas (melhor feito durante a alimentação).
nota: Cuidados de longa permanência e alojamento: O animal operado é mantido isolado por 24 h. Ele é colocado de volta em seu grupo social original se o animal estiver bem o suficiente para interagir socialmente com seus pares. A observação diária do pedestal e da abertura da pele precisa ser realizada para acompanhar a integração do dispositivo na cabeça. Quando apropriado, limpe o local ao redor do pedestal com grandes quantidades de betadine.
2. Registro eletrofisiológico
- Atividade espontânea: Conecte o sistema de gravação sem fio através do pedestal e registre a atividade da linha de base por 2-3 min. Essas gravações servirão como controle para analisar os potenciais evocados auditivos.
- Potenciais evocados auditivos: Além do sistema sem fio, insira os alto-falantes em um campo fechado nas orelhas dos animais. Toque a estimulação acústica tone burst em diferentes frequências (variando de 200 a 20.000 Hz) em torno de 70 dB de nível de pressão sonora (SPL) em 120 repetições. Em seguida, calcule a média das gravações e alinhe-as ao longo do período de estímulo para análise.
- Potenciais evocados sensoriais: Coloque as agulhas no focinho em três posições diferentes. Evoque potenciais sensoriais estimulando o focinho por ~ 30 s com o gerador de pulsos em diferentes amplitudes para obter as curvas de recrutamento.
3. Gravação em movimento livre
- Siga o mesmo procedimento descrito na seção 2 para registrar sinais acordados do cérebro. Conecte o headstage sem fio segurando o animal nos braços do experimentador ou alimentando-o com guloseimas para distraí-lo. Forneça a estimulação acústica usando alto-falantes externos colocados próximos ao animal.
