Registro do potencial de campo local em fatias do córtex hipocampal-entorrinal de camundongos

Resumo

Fonte: Whitebirch, A. C. Fatiamento agudo do cérebro de camundongos para investigar a atividade espontânea da rede hipocampal. J. Vis. Exp. (2020)

O vídeo demonstra um procedimento para registrar o potencial de campo local (LFP) em fatias do córtex hipocampal-entorrinal de camundongos. A estimulação elétrica é fornecida no estrato radiato CA3 do hipocampo, o que causa alterações no potencial pós-sináptico no estrato CA1 piramidal. A mudança combinada no potencial de membrana dos neurônios CA1, denominada potencial de campo local, é registrada.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Perfusão transcárdica

1. Suspenda uma seringa com capacidade de 60 mL como reservatório para solução de corte de sacarose aproximadamente 18 polegadas acima da bancada (por exemplo, usando um giro de três pontas clamp em um poste vertical). Prenda a tubulação no fundo do reservatório, passe a tubulação por uma braçadeira de rolo e conecte a outra extremidade do tubo a uma agulha limpa de 20 G.
2. Encha o reservatório de 60 mL com aproximadamente 30 mL de solução de sacarose resfriada e direcione uma linha de carbogênio para o reservatório de sacarose para borbulhar continuamente o perfusato.
   nota: Certifique-se de que a sacarose esteja fluindo através do tubo e da agulha sem bolhas presas. A taxa de fluxo deve ser rápida o suficiente para ter um fluxo constante e contínuo de sacarose pingando da agulha.
3. Usando um liquidificador, esmague e misture a sacarose congelada em uma pasta gelada e use a espátula/colher grande para distribuir a pasta.
   1. Coloque uma pequena quantidade de pasta de sacarose ao redor das bordas da tampa da placa de Petri de vidro. Adicione uma pequena quantidade de pasta de sacarose ao fundo da placa de Petri.
   2. Adicione cerca de 20 a 30 mL de pasta de sacarose ao reservatório de fluido de perfusão, misturando-o bem com os 30 mL de sacarose líquida resfriada até que o reservatório contenha uma mistura de sacarose muito fria, predominantemente líquida, com alguma solução congelada remanescente.
4. Coloque o mouse em uma câmara conectada a um vaporizador de isoflurano. Com o oxigênio fluindo a aproximadamente 2 L/min, gire o botão do vaporizador para fornecer isoflurano na concentração de 5% e inicie um temporizador.
   nota: Mantenha este cronômetro funcionando durante todo o corte para avaliar a rapidez com que as fatias são obtidas. O procedimento deve ser feito o mais rápido possível, de modo que o corte esteja completo e o tecido esteja se recuperando na câmara de interface dentro de 15 a 20 minutos após o animal entrar na câmara de isoflurano. Observe o mouse para garantir que um estado de anestesia profunda seja alcançado. Após um mínimo de 5 minutos, o mouse deve estar profundamente anestesiado e sem responder aos beliscões dos dedos dos pés.
5. Imediatamente antes de remover o camundongo da câmara de isoflurano, encha a tampa da placa de Petri com solução de sacarose resfriada a uma profundidade de aproximadamente 3–5 mm e encha o fundo da placa de Petri com solução de sacarose resfriada a uma profundidade de aproximadamente 1.0 cm.
6. Transfira rapidamente o mouse para a almofada absorvente esquerda e use os 3 pedaços de fita adesiva para prender os membros anteriores e a cauda. Faça uma pinça do dedo do pé do membro posterior para garantir que o mouse não responda antes de qualquer incisão ser realizada. Usando a pinça de tecido grande e a tesoura cirúrgica, cubra a pele e faça uma incisão longitudinal da parte inferior do esterno até o topo do peito. Usando a pinça, puxe o esterno para cima e use a tesoura para cortar o diafragma.
   nota: O posicionamento inicial do camundongo e as primeiras várias incisões para cortar o diafragma devem ser realizados o mais rápido possível para garantir que o camundongo não recupere a consciência. Para garantir uma profundidade adequada de anestesia durante todo o procedimento, um cone nasal pode ser colocado no camundongo para administrar isoflurano durante a perfusão.
7. Use a tesoura para cortar a caixa torácica de cada lado, cortando em um grande movimento em direção ao ponto onde o membro anterior encontra o corpo. Com a pinça, balance a frente da caixa torácica para longe e para cima em direção à cabeça e, em seguida, remova-a totalmente com um corte horizontal usando uma tesoura grande. Segure o coração no lugar usando a pinça grande e insira a agulha de perfusão 20 G no ventrículo esquerdo. Uma vez que a agulha esteja posicionada corretamente, o lado esquerdo do coração deve empalidecer rapidamente à medida que a solução de sacarose gelada preenche o ventrículo.
8. Use a pequena tesoura dissector para cortar o átrio direito e permitir que o sangue flua para fora do sistema circulatório. Se as incisões forem realizadas corretamente, deve haver danos mínimos ao coração, e ele deve continuar bombeando durante toda a perfusão.
   nota: Pedaços enrolados de papel de seda podem ser usados para absorver o sangue e a solução de sacarose do coração e manter a visibilidade da agulha de perfusão durante o procedimento.
9. Certifique-se de que a agulha de perfusão permaneça no lugar e não caia do ventrículo esquerdo. Com uma taxa de fluxo e posicionamento adequados, o fígado começará a empalidecer para uma cor bronzeada / bege clara com 20 a 30 s.
10. Após 30 a 45 s, use a tesoura grande para decapitar o mouse. Segurando a cabeça com a mão esquerda, empurre ou retire a pele do crânio. Em um animal bem perfundido, o crânio deve ser muito pálido e o cérebro deve aparecer com uma cor rosa muito clara (aproximando-se do branco) através do crânio sem vasos sanguíneos claramente visíveis.

2. Extraia o cérebro e corte fatias

1. Usando a pequena tesoura de Bonn, faça dois cortes laterais no crânio em direção à linha média na frente do crânio, perto dos olhos. Faça dois cortes adicionais em cada lado da base do crânio.
2. Transfira a cabeça para o fundo da placa de Petri de vidro, onde deve ser imersa principalmente em solução de sacarose gelada. Use a pequena tesoura de Bonn para cortar a linha média ao longo do comprimento do crânio, puxando para cima com a tesoura para minimizar os danos ao tecido cerebral subjacente. Usando a pequena pinça de tecido, segure firmemente cada lado do crânio e balance-o para cima e para longe do cérebro, como se abrisse um livro.
3. Use os dedos da mão esquerda para manter as abas do crânio abertas e insira a microespátula sob o cérebro perto dos bulbos olfatórios. Vire o cérebro do crânio para a sacarose e use a microespátula para cortar o tronco cerebral. Lave o cérebro para remover qualquer resíduo de sangue, pêlo ou outros tecidos.
4. Use a espátula / colher grande para transferir o cérebro para a tampa da placa de Petri de vidro. Com a outra metade da lâmina de barbear de dois gumes previamente reservada, faça dois cortes coronais para remover primeiro o cerebelo e depois a porção mais anterior do cérebro, incluindo os bulbos olfatórios (Figura 1).
5. Aplique adesivo de cianoacrilato na rampa de ágar. Muito brevemente, coloque o cérebro em um pedaço de papel de filtro seco usando a pinça de tecido grande e, em seguida, transfira-o imediatamente para a rampa de ágar, colocando a superfície ventral do cérebro no adesivo.
   nota: Para fatias do hipocampo intermediário, o cérebro deve ser orientado com a anterior voltada para cima na encosta da rampa e a posterior mais próxima da lâmina. Para fatias do hipocampo ventral, oriente o cérebro com a extremidade anterior apontada para baixo na encosta da rampa, com a extremidade posterior no topo da rampa, mais longe da lâmina. Em ambos os casos, o cérebro deve ser posicionado no topo da rampa, de modo que a superfície cortada coronalmente do cérebro entre em contato com o bloco de suporte do ágar (Figura 1).
6. Coloque a plataforma de fatiamento com o ágar e o cérebro na câmara de fatiamento do micrótomo e mergulhe completamente com solução de sacarose resfriada. Use a espátula / colher grande para transferir um pouco de pasta de sacarose para a câmara, mexendo para derreter qualquer sacarose congelada e reduzir rapidamente a temperatura da mistura para ~ 1–2 ° C.
   nota: Observe o medidor de temperatura durante todo o corte. Se a solução de sacarose aquecer acima de 3 °C, adicione mais pasta e misture para baixar a temperatura.
7. Corte fatias com espessura de 450 μm com a velocidade do micrótomo ajustada para 0.07 mm/s. À medida que cada fatia é liberada, use a pequena pinça de tecido e um bisturi afiado para primeiro separar os dois hemisférios e, em seguida, cortar o tecido até que a fatia consista principalmente nas regiões do hipocampo e do parahipocampo (Figura 1).
8. Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir as fatias individualmente para a câmara de recuperação da interface, garantindo que elas sejam posicionadas na interface do ACSF e do ar com apenas um menisco fino de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) cobrindo as fatias. Fechar bem a tampa da câmara e deixar recuperar as fatias a 32 °C durante 30 min.
9. Após a recuperação inicial a 32 °C, retirar a câmara de recuperação da interface do banho-maria e colocá-la num agitador regulado para uma velocidade lenta de modo a que a barra de agitação magnética favoreça a circulação da FCSF no interior da câmara. Deixe esfriar gradualmente até a temperatura ambiente enquanto as fatias se recuperam por mais 90 min. Certifique-se de que a câmara de recuperação esteja continuamente borbulhada com carbogênio e não permita que bolhas grandes fiquem presas sob as fatias.

3. Realize registros de potencial de campo local (LFP) de atividade espontânea

1. Prepare-se para gravações LFP ligando todos os equipamentos necessários, incluindo o computador que executa o software de aquisição, o monitor conectado ao computador, os estimuladores, o micromanipulador, o controlador de temperatura, a fonte de luz do microscópio, a câmera conectada ao microscópio, o amplificador de microeletrodo, o digitalizador e a bomba peristáltica. Se estiver usando um sistema de vácuo central, abra a válvula de parede para preparar a linha de vácuo que removerá o ACSF da câmara de registro.
2. Encha o reservatório aquecido com ACSF e, em seguida, coloque uma extremidade do tubo no copo de 400 mL contendo o ACSF borbulhante. Ligue a bomba peristáltica para direcionar o ACSF do copo de 400 mL para o reservatório aquecido e do reservatório para a câmara de registro. Toque ou aperte o tubo para liberar quaisquer bolhas presas.
3. Ajuste a bomba peristáltica para garantir que a taxa de fluxo ACSF através da câmara de registro seja rápida (~ 8–10 mL/min). Use uma sonda de temperatura para garantir que o ACSF esteja a 32 °C no centro da câmara de registro.
   nota: Se o ACSF for fornecido à câmara de registro usando uma bomba peristáltica, uma alta vazão pode resultar em uma flutuação significativa na vazão. Taxas de fluxo consistentes podem ser alcançadas usando um amortecedor de pulsação simples que consiste em uma série de seringas vazias integradas à tubulação (Figura 2).
4. Prepare pipetas de estimulação e registro de capilares de vidro borossilicato usando um extrator de filamento aquecido. O protocolo do extrator deve ser configurado para produzir pipetas com resistência de 2–3 MOhm para estimulação ou eletrodos de registro de potencial de campo local.
5. Encha as pipetas de estimulação com NaCl 1 M e as pipetas LFP com ACSF.
6. Brevemente clamp a tubulação e desligue a bomba para pausar o fluxo de ACSF. Transfira uma fatia para a câmara de gravação usando uma pinça fina para segurar um canto do papel da lente em que a fatia está apoiada - a fatia grudará no papel da lente. Coloque o papel da lente e corte na câmara de gravação com a fatia voltada para baixo e, em seguida, "retire" o papel da lente, deixando a fatia submersa na câmara de gravação. Prenda a fatia usando uma harpa.
   nota: As harpas podem ser compradas pré-fabricadas ou feitas em laboratório usando uma peça em forma de U de aço inoxidável ou platina e filamento de nylon fino.
7. Coloque uma pipeta de estimulação cheia de NaCl no micromanipulador manual e avance lentamente a ponta da pipeta na superfície da fatia (por exemplo, na camada de estrato radiato) em um ângulo de aproximadamente 30–45°. Assim que a ponta da pipeta entrar no tecido, avance a pipeta lentamente para frente e evite grandes movimentos na direção lateral ou vertical que possam danificar desnecessariamente os axônios dentro da fatia. Coloque a ponta da pipeta a pelo menos 50–100 μm de profundidade na fatia para evitar células próximas à superfície que foram danificadas durante o corte.
8. Coloque uma pipeta LFP cheia de ACSF no suporte da pipeta conectado ao micromanipulador motorizado. Aplique uma pressão positiva muito leve usando a pressão da boca ou uma seringa de 1 mL conectada por meio de uma válvula de torneira e um pequeno pedaço de tubo ao porta-pipeta.
   nota: Posicione as pipetas LFP dentro da fatia para registrar os sinais de interesse: no caso de ondulações de ondas agudas, uma pipeta LFP deve ser colocada no estrato piramidal (SP) e uma segunda pipeta no estrato radiado (SR). Essa configuração permite gravações simultâneas da onda aguda negativa no SR e da oscilação de ondulação de alta frequência no SP (Figura 3).
9. Usando o micromanipulador, avance lentamente a ponta da pipeta LFP para a região de interesse (por exemplo, a camada de células piramidais CA1) em um ângulo de aproximadamente 30–45°. Coloque a ponta da pipeta a pelo menos 50–100 μm de profundidade na fatia para evitar células próximas à superfície que foram danificadas durante o corte. Enquanto avança a pipeta LFP, forneça continuamente um pequeno pulso de teste de tensão usando o software de aquisição e observe um aumento repentino na resistência do eletrodo. Isso pode indicar que a pipeta foi entupida ou pressionada contra uma célula.
10. Uma vez que a pipeta LFP esteja posicionada na região de interesse, libere cuidadosamente a pressão positiva abrindo a válvula na tubulação conectada ao porta-pipeta.
11. Para registrar o LFP em um segundo local simultaneamente, repita as etapas 6.8 a 6.10 com uma segunda pipeta e micromanipulador.
12. Use o amplificador de microeletrodo na configuração de pinça de corrente para registrar a atividade espontânea no potencial de campo local após usar a função de equilíbrio de ponte no software de aquisição para corrigir a resistência em série da pipeta. Ondulações espontâneas de ondas agudas (SWRs) aparecerão como deflexões positivas no potencial extracelular da camada SP (Figura 3).
13. Para registrar os potenciais de campo evocados, use os estimuladores conectados ao digitalizador para fornecer um pulso de tensão quadrada curto (200 us) através da pipeta de estimulação cheia de NaCl. Ajuste o volume de estimulaçãotage dial para evocar uma faixa de amplitudes de resposta.

Resultados

Figura 1: Preparação de fatias horizontais angulares do córtex hipocampo-entorrinal (HEC). (UMA)(i) Depois de extrair o cérebro, faça dois cortes coronais com uma lâmina de barbear para remover as porções posterior e anterior do cérebro. (ii) A rampa de ágar é formada por duas porções angulares coladas à plataforma de corte do micrótomo. Para prepara...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suporte de incubação de fatia de cérebro agudo	Troca de impressão 3D do NIH	3DPX-001623	Desenhado por ChiaMing Lee, disponível na https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Sal de adenosina 5′-trifosfato de magnésio	Sigma Aldrich	Rolamento A9187-500MG
Pellets moídos Ag-Cl	Warner	64-1309, (E205)
Ágar	Becton, Dickinson	214530-500 ouros
ácido ascórbico	Alfa Aesar	Rolamento 36237
copo (250 mL)	Kimax	14000-250
copo (400 mL)	Kimax	14000-400
biocitina	Sigma Aldrich	B4261
liquidificador	Oster	BRLY07-B00-NP0
Tesoura Bonn, pequena	becton, Dickinson	Rolamento 14184-09
capilares de vidro borossilicato com filamento (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm, comprimento 10 cm)	Instrumentos Sutter	BF150-86-10HP	Os capilares polidos a fogo são preferíveis.
solução de cloreto de cálcio (1 M)	G-Biociências	R040
câmera	Olimpo	OLY-150
Gás carbogênio comprimido (95% de oxigênio / 5% de dióxido de carbono)	Gás de ar	X02OX95C2003102
Oxigênio comprimido	Gás de ar	OX 200
Estimulador isolado de tensão constante	Digitimer Ltda.	DS2A-Mk.II
lamínulas (22x50 mm)	VWR	16004-314
adesivo de cianoacrilato	Cola Krazy	KG925	Idealmente, use a forma de pincel para precisão
software de aquisição de dados	Axógrafo	N/A	Qualquer software equivalente (por exemplo, pClamp) funcionaria.
Desktop de workstation em torre Dell Precision T1500	vale	N/A	O número de catálogo dependerá do computador específico - qualquer computador funcionará, desde que possa executar um software de aquisição de eletrofisiologia.
Digidata 1440A	Dispositivos Moleculares	Telefone: 1-2950-0367
temporizador digital	VWR	Nº 62344-641	Temporizador rastreável de 4 canais
almofadas absorventes descartáveis	VWR	Rolamento 56616-018
tesouras de dissector	Ferramentas de Belas Ciências	14082-09
lâminas de barbear de dois gumes	Personna	BP9020
controlador de temperatura automático duplo	Corporação Warner Instrument	TC-344B
câmara de gravação otimizada de superfície dupla ou fluxo laminar	N/A	N/A	A câmara apresentada neste protocolo é feita sob medida. Um equivalente comercial seria o RC-27L da Warner Instruments.
rack de equipamentos	Automatize o Scientific	FR-EQ70"	Um rack não é estritamente necessário, mas útil para organizar a eletrofisiologia
Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiéter)- N,N,N',N'-teetraacético (EGTA)	Sigma Aldrich	324626-25GM
papel de filtro	O que homem	Rolamento 1004 070
escala fina	Mettler Toledo	XS204DR
Extrator de micropipeta flamejante/marrom	Instrumentos Sutter	Pág. 97
placa de Petri de vidro (100 x 15 mm)	Corning	3160-101
glicose	Fisher Científico	D16-1
Guanosina 5′-trifosfato de sódio sal hidratado	Sigma Aldrich	G8877-250MG
baldes de gelo	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
vaporizador de isoflurano	Serviços de anestesia geral	Técnico 3
fita de laboratório	Fisher Científico	15-901-10R
papel da lente	Fisher Científico	11-996
luz	Olimpo	TH4-100
solução de cloreto de magnésio (1 M)	Qualidade Biológica	351-033-721EA
barras de agitação magnéticas	Fisher Científico	14-513-56	O número de catálogo dependerá do tamanho da barra de agitação.
micromanipulador	Luigs & Neumann	SM-5
Micromanipulador (manual)	Scientifica	LBM-2000-00
microscópio	Olimpo	BX51WI
microespátula	Ferramentas de Belas Ciências	10089-11
monitor	vale	2007FPb
Amplificador de microeletrodo MultiClamp 700B	Dispositivos Moleculares	MULTICLAMP 700B	O MultiClamp 700B deve incluir headstages, porta-pipetas e uma célula modelo.
N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanossulfônico), (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375-25G
agulha (calibre 20, 1,5 de comprimento)	Becton, Dickinson	305176
filamento de nylon	YLI Wonder Fio Invisível	212-15-004	tamanho 0,004. Este gato. # é de Amazon.com
em malha de nylon	Corporação Warner Instruments	Nº 64-0198
bomba perstáltica	Aparelho de Harvard	70-2027
Sal de fosfocreatina di(tris)	Sigma Aldrich	Pág. 1937-1G
Porta-pipetas	Dispositivos Moleculares	1-HL-U
fio de platina	Precisão Mundial	PT0203
filamento de ácido polilático (PLA)	Ultimaker	RAL 9010
potássio	Sigma Aldrich	Rolamento P3911-500G
gluconato de potássio	Sigma Aldrich	1550001-200MG
hidróxido de potássio	Sigma Aldrich	60377-1KG
Lâminas	VWR	Rolamento 55411-050
abraçadeira de rolos	Instrumentos de precisão mundiais	Rolamento 14041
escala	Mettler Toledo	PM2000
Cabo de bisturi	Ferramentas de Belas Ciências	10004-13
fatia harpa	Warner	SHD-26GH/2
bicarbonato de sódio	Fisher Química	S233-500
cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S9888-1KG
fosfato de sódio monobásico anidro	Fisher Química	S369-500
piruvato de sódio	Fisher Química	BP356-100
espátula	VWR	82027-520
espátula/colher, grande	VWR	Rolamento 470149-442
lâminas de bisturi estéreis	pena	Rolamento 72044-10
agitador / placa quente	Corning	Nº 6795-220
Válvulas de torneira, 1 via	Instrumentos de precisão mundiais	Rolamento 14054
Válvulas de torneira, 3 vias	Instrumentos de precisão mundiais	Rolamento 14036
sacarose	Acros Orgânicos	AC177142500
Suporte para grampos giratórios	Fisher Científico	14-679Q
tesouras cirúrgicas, afiadas/rombas	Ferramentas de Belas Ciências	14001-12
(1 mL)	Becton, Dickinson	309659
(60 mL com ponta Luer-Lok)	Becton, Dickinson	309653
Grampo de três pontas	Fisher Científico	05-769-8Q
pinça de tecidos, grande	Ferramentas de Belas Ciências	11021-15
pinça de tecido pequeno	Ferramentas de Belas Ciências	11023-10
pipetas de transferência	Fisher Científico	13-711-7M
tubulação	Tygon	E-3603	ID 1/16 polegada, OD 3/16 polegada
tubulação	Tygon	R-3603	ID 1/8 de polegada, OD 1/4 de polegada
graxa a vácuo	Dow Corning	14-635-5D
micrótomo com lâmina vibratória	Leica	VT 1200S
Mesa de amortecimento de vibrações com gaiola de Faraday	Micro-G / TMC-ametek	2536-516-4-30PE
balão volumétrico (1 L)	Kimax	KIM-28014-1000
Balão volumétrico (2 L)	Pyrex	Nº 65640-2000
banho-maria morno	VWR	1209