Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Perfusão transcárdica
- Suspenda uma seringa com capacidade de 60 mL como reservatório para solução de corte de sacarose aproximadamente 18 polegadas acima da bancada (por exemplo, usando um giro de três pontas clamp em um poste vertical). Prenda a tubulação no fundo do reservatório, passe a tubulação por uma braçadeira de rolo e conecte a outra extremidade do tubo a uma agulha limpa de 20 G.
- Encha o reservatório de 60 mL com aproximadamente 30 mL de solução de sacarose resfriada e direcione uma linha de carbogênio para o reservatório de sacarose para borbulhar continuamente o perfusato.
nota: Certifique-se de que a sacarose esteja fluindo através do tubo e da agulha sem bolhas presas. A taxa de fluxo deve ser rápida o suficiente para ter um fluxo constante e contínuo de sacarose pingando da agulha.
- Usando um liquidificador, esmague e misture a sacarose congelada em uma pasta gelada e use a espátula/colher grande para distribuir a pasta.
- Coloque uma pequena quantidade de pasta de sacarose ao redor das bordas da tampa da placa de Petri de vidro. Adicione uma pequena quantidade de pasta de sacarose ao fundo da placa de Petri.
- Adicione cerca de 20 a 30 mL de pasta de sacarose ao reservatório de fluido de perfusão, misturando-o bem com os 30 mL de sacarose líquida resfriada até que o reservatório contenha uma mistura de sacarose muito fria, predominantemente líquida, com alguma solução congelada remanescente.
- Coloque o mouse em uma câmara conectada a um vaporizador de isoflurano. Com o oxigênio fluindo a aproximadamente 2 L/min, gire o botão do vaporizador para fornecer isoflurano na concentração de 5% e inicie um temporizador.
nota: Mantenha este cronômetro funcionando durante todo o corte para avaliar a rapidez com que as fatias são obtidas. O procedimento deve ser feito o mais rápido possível, de modo que o corte esteja completo e o tecido esteja se recuperando na câmara de interface dentro de 15 a 20 minutos após o animal entrar na câmara de isoflurano. Observe o mouse para garantir que um estado de anestesia profunda seja alcançado. Após um mínimo de 5 minutos, o mouse deve estar profundamente anestesiado e sem responder aos beliscões dos dedos dos pés.
- Imediatamente antes de remover o camundongo da câmara de isoflurano, encha a tampa da placa de Petri com solução de sacarose resfriada a uma profundidade de aproximadamente 3–5 mm e encha o fundo da placa de Petri com solução de sacarose resfriada a uma profundidade de aproximadamente 1.0 cm.
- Transfira rapidamente o mouse para a almofada absorvente esquerda e use os 3 pedaços de fita adesiva para prender os membros anteriores e a cauda. Faça uma pinça do dedo do pé do membro posterior para garantir que o mouse não responda antes de qualquer incisão ser realizada. Usando a pinça de tecido grande e a tesoura cirúrgica, cubra a pele e faça uma incisão longitudinal da parte inferior do esterno até o topo do peito. Usando a pinça, puxe o esterno para cima e use a tesoura para cortar o diafragma.
nota: O posicionamento inicial do camundongo e as primeiras várias incisões para cortar o diafragma devem ser realizados o mais rápido possível para garantir que o camundongo não recupere a consciência. Para garantir uma profundidade adequada de anestesia durante todo o procedimento, um cone nasal pode ser colocado no camundongo para administrar isoflurano durante a perfusão.
- Use a tesoura para cortar a caixa torácica de cada lado, cortando em um grande movimento em direção ao ponto onde o membro anterior encontra o corpo. Com a pinça, balance a frente da caixa torácica para longe e para cima em direção à cabeça e, em seguida, remova-a totalmente com um corte horizontal usando uma tesoura grande. Segure o coração no lugar usando a pinça grande e insira a agulha de perfusão 20 G no ventrículo esquerdo. Uma vez que a agulha esteja posicionada corretamente, o lado esquerdo do coração deve empalidecer rapidamente à medida que a solução de sacarose gelada preenche o ventrículo.
- Use a pequena tesoura dissector para cortar o átrio direito e permitir que o sangue flua para fora do sistema circulatório. Se as incisões forem realizadas corretamente, deve haver danos mínimos ao coração, e ele deve continuar bombeando durante toda a perfusão.
nota: Pedaços enrolados de papel de seda podem ser usados para absorver o sangue e a solução de sacarose do coração e manter a visibilidade da agulha de perfusão durante o procedimento.
- Certifique-se de que a agulha de perfusão permaneça no lugar e não caia do ventrículo esquerdo. Com uma taxa de fluxo e posicionamento adequados, o fígado começará a empalidecer para uma cor bronzeada / bege clara com 20 a 30 s.
- Após 30 a 45 s, use a tesoura grande para decapitar o mouse. Segurando a cabeça com a mão esquerda, empurre ou retire a pele do crânio. Em um animal bem perfundido, o crânio deve ser muito pálido e o cérebro deve aparecer com uma cor rosa muito clara (aproximando-se do branco) através do crânio sem vasos sanguíneos claramente visíveis.
2. Extraia o cérebro e corte fatias
- Usando a pequena tesoura de Bonn, faça dois cortes laterais no crânio em direção à linha média na frente do crânio, perto dos olhos. Faça dois cortes adicionais em cada lado da base do crânio.
- Transfira a cabeça para o fundo da placa de Petri de vidro, onde deve ser imersa principalmente em solução de sacarose gelada. Use a pequena tesoura de Bonn para cortar a linha média ao longo do comprimento do crânio, puxando para cima com a tesoura para minimizar os danos ao tecido cerebral subjacente. Usando a pequena pinça de tecido, segure firmemente cada lado do crânio e balance-o para cima e para longe do cérebro, como se abrisse um livro.
- Use os dedos da mão esquerda para manter as abas do crânio abertas e insira a microespátula sob o cérebro perto dos bulbos olfatórios. Vire o cérebro do crânio para a sacarose e use a microespátula para cortar o tronco cerebral. Lave o cérebro para remover qualquer resíduo de sangue, pêlo ou outros tecidos.
- Use a espátula / colher grande para transferir o cérebro para a tampa da placa de Petri de vidro. Com a outra metade da lâmina de barbear de dois gumes previamente reservada, faça dois cortes coronais para remover primeiro o cerebelo e depois a porção mais anterior do cérebro, incluindo os bulbos olfatórios (Figura 1).
- Aplique adesivo de cianoacrilato na rampa de ágar. Muito brevemente, coloque o cérebro em um pedaço de papel de filtro seco usando a pinça de tecido grande e, em seguida, transfira-o imediatamente para a rampa de ágar, colocando a superfície ventral do cérebro no adesivo.
nota: Para fatias do hipocampo intermediário, o cérebro deve ser orientado com a anterior voltada para cima na encosta da rampa e a posterior mais próxima da lâmina. Para fatias do hipocampo ventral, oriente o cérebro com a extremidade anterior apontada para baixo na encosta da rampa, com a extremidade posterior no topo da rampa, mais longe da lâmina. Em ambos os casos, o cérebro deve ser posicionado no topo da rampa, de modo que a superfície cortada coronalmente do cérebro entre em contato com o bloco de suporte do ágar (Figura 1).
- Coloque a plataforma de fatiamento com o ágar e o cérebro na câmara de fatiamento do micrótomo e mergulhe completamente com solução de sacarose resfriada. Use a espátula / colher grande para transferir um pouco de pasta de sacarose para a câmara, mexendo para derreter qualquer sacarose congelada e reduzir rapidamente a temperatura da mistura para ~ 1–2 ° C.
nota: Observe o medidor de temperatura durante todo o corte. Se a solução de sacarose aquecer acima de 3 °C, adicione mais pasta e misture para baixar a temperatura.
- Corte fatias com espessura de 450 μm com a velocidade do micrótomo ajustada para 0.07 mm/s. À medida que cada fatia é liberada, use a pequena pinça de tecido e um bisturi afiado para primeiro separar os dois hemisférios e, em seguida, cortar o tecido até que a fatia consista principalmente nas regiões do hipocampo e do parahipocampo (Figura 1).
- Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir as fatias individualmente para a câmara de recuperação da interface, garantindo que elas sejam posicionadas na interface do ACSF e do ar com apenas um menisco fino de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) cobrindo as fatias. Fechar bem a tampa da câmara e deixar recuperar as fatias a 32 °C durante 30 min.
- Após a recuperação inicial a 32 °C, retirar a câmara de recuperação da interface do banho-maria e colocá-la num agitador regulado para uma velocidade lenta de modo a que a barra de agitação magnética favoreça a circulação da FCSF no interior da câmara. Deixe esfriar gradualmente até a temperatura ambiente enquanto as fatias se recuperam por mais 90 min. Certifique-se de que a câmara de recuperação esteja continuamente borbulhada com carbogênio e não permita que bolhas grandes fiquem presas sob as fatias.
3. Realize registros de potencial de campo local (LFP) de atividade espontânea
- Prepare-se para gravações LFP ligando todos os equipamentos necessários, incluindo o computador que executa o software de aquisição, o monitor conectado ao computador, os estimuladores, o micromanipulador, o controlador de temperatura, a fonte de luz do microscópio, a câmera conectada ao microscópio, o amplificador de microeletrodo, o digitalizador e a bomba peristáltica. Se estiver usando um sistema de vácuo central, abra a válvula de parede para preparar a linha de vácuo que removerá o ACSF da câmara de registro.
- Encha o reservatório aquecido com ACSF e, em seguida, coloque uma extremidade do tubo no copo de 400 mL contendo o ACSF borbulhante. Ligue a bomba peristáltica para direcionar o ACSF do copo de 400 mL para o reservatório aquecido e do reservatório para a câmara de registro. Toque ou aperte o tubo para liberar quaisquer bolhas presas.
- Ajuste a bomba peristáltica para garantir que a taxa de fluxo ACSF através da câmara de registro seja rápida (~ 8–10 mL/min). Use uma sonda de temperatura para garantir que o ACSF esteja a 32 °C no centro da câmara de registro.
nota: Se o ACSF for fornecido à câmara de registro usando uma bomba peristáltica, uma alta vazão pode resultar em uma flutuação significativa na vazão. Taxas de fluxo consistentes podem ser alcançadas usando um amortecedor de pulsação simples que consiste em uma série de seringas vazias integradas à tubulação (Figura 2).
- Prepare pipetas de estimulação e registro de capilares de vidro borossilicato usando um extrator de filamento aquecido. O protocolo do extrator deve ser configurado para produzir pipetas com resistência de 2–3 MOhm para estimulação ou eletrodos de registro de potencial de campo local.
- Encha as pipetas de estimulação com NaCl 1 M e as pipetas LFP com ACSF.
- Brevemente clamp a tubulação e desligue a bomba para pausar o fluxo de ACSF. Transfira uma fatia para a câmara de gravação usando uma pinça fina para segurar um canto do papel da lente em que a fatia está apoiada - a fatia grudará no papel da lente. Coloque o papel da lente e corte na câmara de gravação com a fatia voltada para baixo e, em seguida, "retire" o papel da lente, deixando a fatia submersa na câmara de gravação. Prenda a fatia usando uma harpa.
nota: As harpas podem ser compradas pré-fabricadas ou feitas em laboratório usando uma peça em forma de U de aço inoxidável ou platina e filamento de nylon fino.
- Coloque uma pipeta de estimulação cheia de NaCl no micromanipulador manual e avance lentamente a ponta da pipeta na superfície da fatia (por exemplo, na camada de estrato radiato) em um ângulo de aproximadamente 30–45°. Assim que a ponta da pipeta entrar no tecido, avance a pipeta lentamente para frente e evite grandes movimentos na direção lateral ou vertical que possam danificar desnecessariamente os axônios dentro da fatia. Coloque a ponta da pipeta a pelo menos 50–100 μm de profundidade na fatia para evitar células próximas à superfície que foram danificadas durante o corte.
- Coloque uma pipeta LFP cheia de ACSF no suporte da pipeta conectado ao micromanipulador motorizado. Aplique uma pressão positiva muito leve usando a pressão da boca ou uma seringa de 1 mL conectada por meio de uma válvula de torneira e um pequeno pedaço de tubo ao porta-pipeta.
nota: Posicione as pipetas LFP dentro da fatia para registrar os sinais de interesse: no caso de ondulações de ondas agudas, uma pipeta LFP deve ser colocada no estrato piramidal (SP) e uma segunda pipeta no estrato radiado (SR). Essa configuração permite gravações simultâneas da onda aguda negativa no SR e da oscilação de ondulação de alta frequência no SP (Figura 3).
- Usando o micromanipulador, avance lentamente a ponta da pipeta LFP para a região de interesse (por exemplo, a camada de células piramidais CA1) em um ângulo de aproximadamente 30–45°. Coloque a ponta da pipeta a pelo menos 50–100 μm de profundidade na fatia para evitar células próximas à superfície que foram danificadas durante o corte. Enquanto avança a pipeta LFP, forneça continuamente um pequeno pulso de teste de tensão usando o software de aquisição e observe um aumento repentino na resistência do eletrodo. Isso pode indicar que a pipeta foi entupida ou pressionada contra uma célula.
- Uma vez que a pipeta LFP esteja posicionada na região de interesse, libere cuidadosamente a pressão positiva abrindo a válvula na tubulação conectada ao porta-pipeta.
- Para registrar o LFP em um segundo local simultaneamente, repita as etapas 6.8 a 6.10 com uma segunda pipeta e micromanipulador.
- Use o amplificador de microeletrodo na configuração de pinça de corrente para registrar a atividade espontânea no potencial de campo local após usar a função de equilíbrio de ponte no software de aquisição para corrigir a resistência em série da pipeta. Ondulações espontâneas de ondas agudas (SWRs) aparecerão como deflexões positivas no potencial extracelular da camada SP (Figura 3).
- Para registrar os potenciais de campo evocados, use os estimuladores conectados ao digitalizador para fornecer um pulso de tensão quadrada curto (200 us) através da pipeta de estimulação cheia de NaCl. Ajuste o volume de estimulaçãotage dial para evocar uma faixa de amplitudes de resposta.
