Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Configuração de gravação eletrofisiológica
- Prenda a pele da orelha externa do camundongo (pavilhão auricular) na base revestida de PDMS de uma câmara de gravação com pinos finos de insetos nas bordas (~ 6-8 por orelha), colocando os nervos limpos na base da orelha perto de dois eletrodos de sucção - um para gravação (para tirar o nervo) e o outro um eletrodo indiferente (para fornecer o sinal neutro a um amplificador diferencial).
- Para o eletrodo de registro, combine cuidadosamente a abertura e o diâmetro interno da abertura com a espessura combinada dos dois nervos, para que eles se encaixem o mais confortavelmente possível e com o maior comprimento possível.
- Puxe os nervos para o eletrodo por sucção suave de uma seringa de 2 ml presa à outra extremidade com tubo de borracha de silicone. Certifique-se de que os nervos estejam retos, não dobrados ou dobrados.
- Desenvolva um ajuste de alta resistência / impedância elétrica usando sucção mais forte para atrair tecido conjuntivo ou tecido adiposo para formar um tampão que veda firmemente a abertura ao redor do nervo.
- Encha o outro eletrodo (indiferente) com solução salina por sucção, se necessário (pode ser preenchido por ação capilar).
- Coloque fios de gravação idênticos (prata ou platina) no orifício interno dos eletrodos de gravação para entrar em contato com a solução salina e o nervo (gravação) ou extremidade estreitada e polida a fogo (indiferente) do eletrodo. Cada eletrodo é soldado individualmente a diferentes núcleos de cabo blindado de dois núcleos. Coloque o eletrodo de banho (terra) (pellet Ag/AgCl) no banho e aterre-o na tela do cabo de dois núcleos conectado aos eletrodos de gravação.
- Alimente a atividade elétrica dos dois eletrodos nos canais separados de um amplificador diferencial, filtro (banda passada de 0.2-2 kHz) e view em uma tela de osciloscópio. Verifique se os níveis de ruído elétrico do canal A (gravação) e do canal B (indiferente) são semelhantes. Nesta fase, pode não ser possível ver os potenciais de ação espontâneos normais no canal A antes que os dois eletrodos estejam equilibrados.
- Corrija quaisquer diferenças no ruído de fundo entre os eletrodos aumentando a impedância dos eletrodos de gravação (canal A) ou indiferentes (canal B). Faça isso sugando o tecido conjuntivo areolar (adiposo) ainda mais para dentro do eletrodo e / ou aplicando maior força de sucção na seringa de 50 ml.
- Uma vez 'equilibrado' dessa maneira, volte para o registro diferencial (AB) e procure potenciais de ação espontâneos (APs) no traço ou ao acariciar os cabelos na margem do pavilhão auricular. Se nenhuma atividade (pico) for observada, verifique novamente o ajuste apertado do nervo no eletrodo de registro e o tecido conjuntivo areolar no eletrodo indiferente - geralmente, quanto mais apertada (maior resistência) a vedação e quanto mais igual a impedância nos dois eletrodos, melhor. Com a prática, isso alcançará uma boa relação sinal: ruído (>2:1).
- Registre o eletroneurograma por meio de uma interface de laboratório e software de eletrofisiologia em execução em um computador. Uma saída de áudio de pico é muito útil e pode ser obtida alimentando o neurograma por meio de um amplificador de áudio e alto-falante de áudio associado. Ajuste o limite para ficar logo acima do ruído da linha de base (identificado pela ausência de ruído branco 'chiado').
- Para aumentar o acesso do medicamento ou do corante de estiril fluorescente às terminações lanceoladas, retire cuidadosamente a camada adiposa subdérmica perto da margem do pavilhão auricular, abrindo uma janela de ~ 5 mm x 5 mm, expondo a derme e a base dos folículos ( Figura 1A , B ).
- Prenda uma dobra de ~ 1 mm de pele da orelha limpa com tecido adiposo na margem principal (no nível da janela recém-produzida, se aplicável), deixando uma lacuna clara preenchida com solução salina entre as camadas de pele opostas. Passe suavemente os pelos que se projetam ao longo da borda dobrada com um pino ou pinça fina aterrada, sem tocar a pele, para localizar a área de saída AP máxima no osciloscópio e os 'cliques' e 'estalos' distintos na saída de áudio.
2. Registro de potenciais de ação evocados por estímulo
- Posicione a sonda de estimulação mecânica – um vidro de microeletrodo de borossilicato de 10 cm polido a fogo conectado a um atuador piezoelétrico de cerâmica – de modo que o movimento fique paralelo à dobra cutânea. Coloque a ponta a cerca de 0,5-1 mm da dobra cutânea, de modo que toque os pelos, mas não a pele. Verifique a estimulação eficaz movendo lentamente a ponta da sonda manualmente para desviar os pelos e observar/ouvir os espinhos.
- Use o software para conduzir a estimulação mecânica de 1-3 fios de cabelo (por exemplo, 3 segundos a 5 Hz sinusóides, a cada 10 segundos. Deslocamento da sonda 200-500 μm) e registre as respostas evocadas por estimulação nos nervos.
- Dê vários trens de estimulação mecânica idênticos em intervalos de 10 segundos. Otimize a posição da sonda para repetibilidade e, em seguida, reduza a frequência de estimulação de acordo com o protocolo experimental (por exemplo, taxa de repetição de queda de 10 segundos para 30 segundos).
- Use o software para discriminar atividades semelhantes a APs, por exemplo, usando um limite simples definido para ~2x a amplitude de ruído de alta frequência e ~25% dos maiores APs.
- Conte os APs que cruzam o limiar como 'eventos', quantificando a frequência e as características dos APs produzidos.
3. Gravação de disparo evocado por estímulo combinado com marcação de dibrometo de piridínio N-(3-trietilamôniopropil)-4-(4-(dibutilamino)estiril)
- Para examinar os efeitos dos corantes de estiril no disparo aferente evocado por estímulo e na marcação terminal, adicione a concentração apropriada de um corante de estiril de escolha à solução de banho e continue com o registro elétrico.
- Após o tempo de exposição necessário (geralmente pelo menos 30 min), prepare a preparação para visualizar os folículos. Desdobre o retalho cutâneo removendo os pinos de retenção e exponha a área dérmica limpa para revelar a rotulagem do terminal.
- Lave o corante externo com solução salina sem corante, fazendo 3 trocas completas de solução salina.
- Incube na troca final de solução salina sem corante gaseificado por 10-15 min para permitir que a contaminação mais persistente do corante vaze das membranas expostas/externas.
- Remova o corante não internalizado remanescente nas membranas com um agente sequestrante (beta-ciclodextrina sulfobutilada, 1 mM, 5 min) em solução salina.
- Transfira a câmara de registro para o estágio de um microscópio de epifluorescência vertical e encaixe a câmara com o mecanismo de movimento do estágio/lâmina.
- Ilumine a preparação com luz de excitação apropriada para o corante estiril. Use uma objetiva de microscópio de fluorescência de 10X ou 25X para observar a marcação do folículo (Figura 1).
