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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de Eletrodos e Cabos para Gravações de EEG/EMG
- Prepare o eletrodo de registro de EEG/EMG de acordo com o seguinte procedimento.
nota: O eletrodo é descartável e pode ser usado apenas para 1 animal. Planeje cuidadosamente a configuração da fiação para todos os conectores. Coloque marcas nos conectores para a orientação correta.
- Solde cada pino de um cabeçalho de 4 pinos a um fio de aço inoxidável de 2 cm. Em resumo, segure uma extremidade do fio no pino, coloque um ferro de solda quente na junta do pino do fio e derreta um pouco de solda para garantir que apenas a solda suficiente escorra suavemente na junta. Tenha cuidado para não aplicar muito calor no pino; caso contrário, o plástico ao redor dos pinos derreterá.
- Solde a extremidade livre de cada um dos 2 fios presos ao cabeçalho do pino à cabeça de um parafuso de aço inoxidável de 1.0 mm de diâmetro. Em resumo, segure a extremidade livre do fio na rosca abaixo da cabeça do parafuso, coloque um ferro de solda quente na junta do parafuso do fio e derreta um pouco de solda para garantir que a solda apenas o suficiente escorra suavemente na junta. Os 2 fios com parafusos servem como eletrodos de registro de EEG, enquanto os 2 fios sem parafusos servem como eletrodos de registro de EMG.
- Use uma tesoura para retirar 1 mm do isolamento na extremidade dos eletrodos EMG para aumentar a qualidade do sinal EMG.
- Cubra completamente todos os pinos soldados com adesivo epóxi usando um bastão de madeira fino ou palito de dente para reduzir o ruído elétrico durante as gravações de EEG/EMG.
- Prepare um cabo para conectar o eletrodo ao anel deslizante conforme descrito abaixo. Este cabo pode ser reutilizado.
- Solde cada pino de um conector FFC/FPC de 4 pinos com um fio de um cabo plano de 30 cm. Em resumo, segure a extremidade descascada do fio no pino, coloque um ferro de solda quente na junta do pino do fio e derreta um pouco de solda para garantir que a solda apenas o suficiente escorra suavemente na junta.
Nota: Escolha o comprimento do cabo plano apropriado para a altura da gaiola experimental usada para gravações de EEG/EMG.
- Solde os soquetes de crimpagem em uma ponta dos fios na outra extremidade do cabo plano. Em resumo, segure um soquete de crimpagem na extremidade livre descascada do fio, coloque um ferro de solda quente na junta do soquete do fio e derreta um pouco de solda para garantir que apenas a solda suficiente escorra suavemente na junta.
- Insira cada soquete de crimpagem em um invólucro de crimpagem de 4 posições.
- Cubra completamente os soquetes de crimpagem com adesivo epóxi usando um palito de madeira fino ou palito de dente.
2. Implantação de eletrodos na cabeça do mouse (duração: aprox. 20 min)
- Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em um esterilizador de esferas quentes antes da cirurgia. Anestesiar um camundongo macho (10 a 20 semanas de idade, 20 a 30 g) com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg). Depois de verificar se o mouse está profundamente anestesiado beliscando um dedo do pé, raspe o cabelo da cabeça e do pescoço com uma tesoura.
- Mova o mouse para o quadro estereotáxico e fixe a cabeça entre as 2 barras auriculares. Aplique vaselina nos olhos para evitar o ressecamento. Limpe a pele raspada com álcool e corte-a ao longo da linha média com um bisturi para expor o crânio. Corte a pele para manter a área cirúrgica aberta.
- Usando um cortador de carboneto (tamanho da broca: 0,8 mm de diâmetro), faça 2 furos no crânio, um sobre a área cortical frontal (1 mm anterior ao bregma, 1,5 mm lateral à linha média) e outro sobre a área parietal (1 mm anterior à lambda, 1,5 mm lateral à linha média) do hemisfério direito, de acordo com as coordenadas estereotáxicas de Paxinos e Franklin.
- Usando uma chave de fenda de joalheiro, coloque parafusos de gravação de EEG de aço inoxidável nos orifícios e faça 2 a 2,5 voltas para cada parafuso para posicionamento peridural sobre o córtex.
Nota: Não insira parafusos muito profundos para evitar danos ao tecido cerebral. Verifique se os parafusos estão bem fixados no crânio. Isso é importante para ter sinais de EEG estáveis durante um longo período de múltiplas gravações (normalmente, mais de 1 mês). Parafusos ondulados produzem artefatos de EEG e podem sair antes do final do cronograma experimental.
- Fixe o conjunto do eletrodo (cf. Seção 1.1, pinos voltados para cima) com cola instantânea no crânio e cubra-o com cimento dentário. Faça pequenos orifícios bilateralmente com pinças nos músculos trapézios (pescoço) e insira os fios de aço inoxidável que servem como eletrodos EMG nos orifícios. Suturar a pele com um fio de seda (0,1 mm de diâmetro) para evitar a exposição do músculo.
- Remova o mouse do quadro estereotáxico. Administre ampicilina (100 mg/kg) e meloxicam (1 mg/kg) por via intraperitoneal ao camundongo para evitar infecção bacteriana e reduzir a dor pós-cirúrgica, respectivamente. Mantenha o mouse em uma almofada térmica e monitore-o até que ele recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Aloje o camundongo individualmente durante a recuperação para evitar a remoção de eletrodos por outros animais e administre meloxicam (1 mg / kg) por via intraperitoneal no primeiro dia após a cirurgia.
3. Registro e aquisição de dados de EEG/EMG
- Após um período de recuperação de 1 semana, aloje cada camundongo individualmente em uma gaiola experimental colocada em uma câmara de gravação à prova de som. Mantenha uma temperatura ambiente de 23 ± 1 °C e controle automaticamente os ciclos de 12 horas de luz/12 horas de escuridão (luzes acesas às 08:00, intensidade de iluminação ~ 100 lux).
- Conecte o conjunto do eletrodo EEG/EMG na cabeça do mouse a um cabo de gravação. Certifique-se de que o cabo de gravação esteja conectado a um anel deslizante (projetado para que os movimentos do mouse não sejam restringidos pela torção do cabo) e um amplificador de sinal EEG/EMG. Filtre sinais de EEG/EMG (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalizar a uma taxa de amostragem de 128 Hz por um conversor analógico-digital (A/D) e, finalmente, gravar em um computador executando o software de gravação EEG/EMG.
- Habitue o mouse por 2 a 3 dias na câmara de gravação.
- Em seguida, inicie o software de gravação de EEG/EMG.
- Selecione a guia 'Informações do arquivo de dados' e clique na caixa ao lado do nome do arquivo. Digite um nome de arquivo e clique em 'Salvar'.
- Selecione a guia 'Condição de gravação' e selecione todos os canais EEG/EMG que serão gravados.
- Selecione a frequência de amostragem (128 Hz) na guia 'Condição de gravação'.
- Verifique se os canais selecionados são exibidos corretamente na guia 'Informações do canal'.
- Selecione a guia 'Configuração do temporizador' e clique em 'Monitor' para exibir EEG e EMG.
- Verifique se os sinais EEG/EMG são exibidos corretamente.
- Selecione a guia 'Configuração do temporizador' e defina a hora do relógio para o início e o fim da gravação na área 'Temporizador principal'.
- Clique em 'Monitor' na guia 'Configuração do temporizador' para iniciar a gravação.
- Registre sinais de EEG / EMG sob a linha de base (ou seja, comportamento de sono / vigília de um camundongo que se comporta livremente). Eutanasiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (200 mg / kg) após o último dia experimental.