$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Dissecar e preparar o SNC da larva de Drosophila
NOTA: Os métodos para dissecção larval do SNC são claramente ilustrados em Hafer e Schedl, mas esses métodos publicados anteriormente reduzem o comprimento dos neurônios descendentes que são importantes para medir a frequência do pico. Aqui, um método adicional é descrito para extirpar o SNC larval que mantém os neurônios descendentes longos e intactos.
- Preparação salina.
- Preparar a dissecção e o registo de solução salina para o seguinte em mM: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfónico (HEPES); titular o pH a 7,25.
- Dissecar a larva Drosophila CNS.
- Identifique e extraia uma Drosophila melanogaster errante de terceiro ínstar do frasco de cultura e coloque em 200 μL de solução salina (Figura 1A).
- Segure os ganchos bucais com uma pinça fina e segure o abdômen da larva com uma segunda pinça (Figura 1B).
nota: Não aplique muita pressão no abdômen, pois isso pode resultar no rompimento da fina camada cuticular da larva.
- Puxe suavemente os ganchos bucais e o abdômen em diferentes direções para separar a extremidade caudal da larva da região da cabeça e expor as vísceras da larva (Figura 1C).
nota: O SNC estará entrelaçado com a traqueia e o trato digestivo. Não corte o SNC de nenhum tecido para evitar o corte dos nervos periféricos descendentes.
- Retire o SNC do trato digestivo e da traqueia com uma pinça (Figura 1D).
- Se necessário, rompa a barreira hematoencefálica seccionando manualmente o SNC posterior aos lobos cerebrais com uma tesoura de mola Vannas.
nota: Isso deve ser feito com base nas propriedades físico-químicas do produto químico que está sendo usado. A linha vermelha na Figura 2A é o ponto de transecção sugerido e o SNC seccionado com troncos nervosos periféricos descendentes intactos mostrados na Figura 2B. O SNC seccionado está pronto para experimentação após a conclusão da etapa 1.2.5.
2. Registro extracelular do SNC de Drosophila.
- Prepare o SNC para gravação.
- Puxe um eletrodo de pipeta de vidro dos capilares de vidro borossilicato para uma resistência de 5-15 mΩ.
- Insira o SNC seccionado na câmara de cera que contém 200 μL de solução salina. Prenda um pino de inseto não revestido com o clipe jacaré soldado ao fio terra e insira o pino na solução salina para completar o circuito.
- Usando os micromanipuladores, oriente o eletrodo para a extremidade caudal do SNC seccionado. Elimine a gravação de ruído de fundo ajustando o nível de limiar no software de aquisição/análise antes de entrar em contato com os troncos nervosos periféricos.
- Puxe todos os nervos periféricos convenientes para o eletrodo de sucção aplicando uma leve pressão negativa na seringa.
nota: A frequência de disparo da linha de base está correlacionada com o número de neurônios atraídos para o eletrodo, onde mais neurônios muitas vezes resultam em aumento da resistência do eletrodo.
- Inicie o registro extracelular da atividade nervosa descendente do SNC.
- Inicie a gravação no software de aquisição de dados e monitore a frequência de disparo da linha de base. Deixe a taxa de disparo se equilibrar por 5 minutos antes de coletar os dados da taxa de disparo da linha de base.
- Rejeitar a preparação e o registo se o padrão de disparo do tratamento de controlo não for um padrão de rebentamento semelhante ao indicado na figura 3A.
nota: O padrão alterado de disparo sugere atividade anormal ou instável do gerador de padrão central, que pode alterar a função neural.
- Após 5 min, adicione 200 μL de solução salina + veículo para trazer o volume total da câmara para 400 μL para começar a registrar as taxas de disparo de controle.
- Após o estabelecimento da linha de base (3-5 min), retirar 200 μL de soro fisiológico e adicionar 200 μL do agente experimental solubilizado em soro fisiológico.
nota: O dimetilsulfóxido (DMSO) é o solvente recomendado para compostos lipofílicos e não deve exceder 0,1% v/v.
- Aplique as concentrações do medicamento de maneira serial (concentrações baixas a altas) e registre cada concentração por um período de tempo selecionado (determinado pelo investigador com base nas propriedades químicas do medicamento). Rotule este ponto de tempo de aplicação do medicamento no software de aquisição/análise, incluindo um comentário que inclua o medicamento e a concentração final.
nota: A atividade de disparo do SNC diminuirá em aproximadamente 10-20% após 30-50 minutos após a dissecção e, portanto, controles apropriados não tratados devem ser realizados e os tratamentos medicamentosos não devem exceder esse período de tempo.
