Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Preparação da configuração do MEA
Nota: Comece 15 minutos antes da gravação.
- Transfira o volume restante de 4AP-ACSF (líquido cefalorraquidiano artificial 4-aminopiridina) para um balão Erlenmeyer de 500 mL.
- Coloque o frasco Erlenmeyer em uma prateleira acima do amplificador MEA (matrizes de microeletrodos) e use tubos para permitir que a solução alimente continuamente uma seringa de 60 mL. Ajustar a altura do balão Erlenmeyer e da seringa de modo a permitir uma taxa de alimentação por gravidade de 1 ml/min.
nota: A altura correta depende do diâmetro interno da tubulação (ID). Para tubos de 5/32 polegadas de diâmetro interno, 30 cm são suficientes.
- Começar a borbulhar o 4AP-ACSF no balão Erlenmeyer e na seringa com uma mistura gasosa de 95% O2/5% CO2.
- Deixe o 4AP-ACSF fluir através do tubo de perfusão para um béquer até que não haja ar no interior; em seguida, pare o fluxo da solução.
- Conecte o elemento de aquecimento na base MEA ao termostato. Coloque o chip MEA seco dentro do amplificador MEA e prenda o ampcabeça do amplificador. Uma pipeta de plástico Pasteur transfere 4AP-ACSF para a entrada e o reservatório externo da câmara de registro.
- Prenda a cânula de aquecimento a um suporte magnético e coloque sua ponta dentro da porta de entrada da câmara de gravação. Conecte o suporte magnético a uma fita magnética no MEA ampcabeça do amplificador. Conecte o tubo de perfusão à cânula. Conecte a cânula ao termostato.
nota: A cânula de aquecimento deve ser coberta por tubos chanfrados de politetrafluoretileno (PTFE) para alcançar a porta de entrada da câmara de gravação e minimizar o ruído devido ao seu material metálico. Quando o reservatório de entrada está adequadamente preenchido com 4AP-ACSF, as gotas que caem do sistema de perfusão não devem ser visíveis.
- Coloque a agulha de sucção dentro do reservatório e verifique se há pressão negativa submergindo-a no ACSF; verifique se há ruído de sucção constante de baixa frequência.
nota: A agulha de sucção deve ser colocada de forma que o 4AP-ACSF flua logo acima da superfície do corte do cérebro. Uma linha de vácuo ou uma bomba de vácuo de baixo ruído pode ser usada.
- Defina o regulador de fluxo para permitir uma vazão de 1 mL/min e comece a perfundir.
nota: A perfusão alimentada por gravidade elimina o ruído que pode ser causado por bombas peristálticas; Se as bombas peristálticas forem preferidas, os modelos de baixo ruído são obrigatórios.
- Assim que o 4AP-ACSF estiver fluindo pela cânula, ligue o termostato. Ajuste a cânula de aquecimento para 37 °C e a base MEA para 32 °C para atingir uma temperatura de 32 - 34 °C dentro da câmara de registro.
NOTA: CUIDADO! Nunca aqueça a cânula sem solução ou ela pode ser irreversivelmente danificada. Defina a temperatura da cânula acima da temperatura de registro (ou seja, 32 - 34 ° C) para levar em conta o deslocamento de temperatura intrínseca entre o valor definido e o valor real na ponta da cânula de aquecimento e dentro da câmara de registro. A taxa de fluxo, a temperatura ambiente e o volume da câmara de registro influenciam a temperatura da solução de registro. As configurações relatadas na etapa 1.9 são otimizadas para o protocolo e o equipamento descritos. Sempre verifique a temperatura real de gravação usando um termopar e ajuste as configurações conforme necessário. Não aqueça a base MEA acima de 34 °C para evitar o superaquecimento da fatia de cérebro.
- Coloque o eletrodo de referência externo no reservatório de entrada da câmara de registro.
nota: Embora os chips MEA sejam equipados com um eletrodo de referência interno, a câmara de gravação personalizada cobre isso. Assim, um eletrodo de referência externo deve ser usado. Um pellet KCl (cloreto de potássio) saturado é o mais prático, pois está pronto para uso sem a necessidade de cloração.
2. Mapeamento ao vivo MEA
- Assim que o nível 4AP-ACSF e a temperatura de gravação estiverem estabilizados conforme desejado, gire a perfusão e as torneiras de sucção para a posição desligada para pará-las temporariamente.
- Transfira rapidamente uma fatia de cérebro para a câmara de gravação MEA usando uma pipeta Pasteur de vidro invertido. Ajuste sua posição na área de gravação MEA conforme necessário usando uma pipeta Pasteur enrolada polida a fogo (Figura 1C) ou uma escova macia e compacta. Coloque a âncora de retenção (Figura 1D) na fatia do cérebro. Reinicie a perfusão e a sucção girando suas torneiras de volta para a posição on.
NOTA: CRÍTICO! O corte deve ser transferido e a perfusão reiniciada dentro de 60 s, ou o tecido pode morrer. A âncora de retenção do corte deve ser mantida em 4AP-ACSF para evitar que o corte do cérebro se mova enquanto coloca a âncora no corte do cérebro devido a diferenças na tensão superficial. A âncora para prender a fatia de cérebro no MEA pode ser feita sob medida usando fio de aço inoxidável e fio de náilon (Figura 1D) ou obtida de fontes comerciais. A Figura 1E mostra a configuração experimental final com o chip MEA conectado à cabeça do amplificador: uma fatia de cérebro apoiada no chip MEA dentro da câmara de gravação é mantida pressionada pela âncora personalizada. O eletrodo de referência (círculo vermelho) e a tubulação de PTFE que cobre a cânula de aquecimento (seta vermelha) estão posicionados no reservatório de entrada, enquanto a agulha de sucção (seta azul) está posicionada no reservatório de saída.
- Tire uma foto da fatia do cérebro usando uma câmera montada em um microscópio invertido.
- Execute o script mapMEA no software do computador para iniciar a GUI para mapear os eletrodos.
nota: O software feito sob medida permite que o usuário selecione os eletrodos que correspondem a estruturas específicas da fatia do cérebro. Esta etapa é crucial para ativar a via correta e suprimir a atividade ictal usando estimulação elétrica.
- Clique no botão Procurar para carregar a imagem da fatia de cérebro. Certifique-se de que o eletrodo de referência apareça na linha superior da metade esquerda do MEA (Figura 2A, marca triangular). Clique no botão Ativar ponteiro e selecione os eletrodos superior e inferior na linha mais à esquerda da matriz para marcar as coordenadas XY para endireitamento de imagem e mapeamento de eletrodos.
- No menu suspenso Tipo de fatia, selecione Horizontal. Marque a caixa de seleção Estruturas padrão.
nota: É possível personalizar as estruturas selecionando o botão Inserir novas estruturas. As estruturas padrão para a fatia horizontal do cérebro são representadas na Figura 2A.
- Usando os botões numerados abaixo da imagem da fatia do cérebro, selecione os eletrodos correspondentes à ROI e clique no botão correspondente no painel de estruturas para atribuí-los (Figura 2B); repita esta etapa para cada ROI.
- Pressione o botão Salvar: o software gera uma pasta de resultados chamada #EXP_LabelledElectrodes contendo uma tabela relatando os eletrodos e ROIs selecionados.
3. Gravação e Modulação Elétrica da Atividade Epileptiforme
- Deixe a fatia do cérebro se estabilizar dentro da câmara de gravação por 5 a 10 minutos antes da gravação.
- Ligue a unidade de estímulo pelo menos 10 minutos antes do protocolo de estimulação para permitir a autocalibração e estabilização. Inicie o software de controle de estímulo e verifique se o estimulador e o amplificador MEA estão conectados corretamente, conforme indicado por um LED verde no painel principal do software de controle de estímulo.
- Configure a estimulação em uma configuração bipolar. Selecione pares de eletrodos em contato com a camada de células piramidais do CA1 / subículo proximal (cf.24,25) entre os mapeados com o script mapMEA (cf. seção 12). Use um fio para conectar um dos eletrodos selecionados ao plugue negativo do estimulador e o outro eletrodo ao plugue positivo do mesmo canal do estimulador. Use outro fio para conectar o aterramento do estimulador ao aterramento do amplificador.
- Inicie o software de gravação. Para adquirir dados, pressione o botão PLAY no painel principal do software de gravação. Registre pelo menos 4 descargas ictais.
nota: Uma frequência de amostragem de 2 kHz permite adquirir potenciais de campo com resolução razoável, minimizando o uso de espaço no disco rígido. Um arquivo de gravação de 5 minutos leva ~ 80 MB. Frequências de amostragem mais altas podem ser necessárias, por exemplo, para registrar artefatos de estímulo ou atividade de várias unidades. Para observar apenas os potenciais de campo, use um filtro passa-baixa ao vivo a 300 Hz para cortar a atividade de várias unidades.
- Determine a intensidade do estímulo.
- No software de controle de estímulos, use o painel principal para projetar uma duração de pulso de corrente positiva-negativa bifásica quadrada de 100 μs/fase.
NOTA: CUIDADO! A estimulação por corrente contínua requer um pulso de carga balanceado para evitar danos ao equipamento.
- Execute um teste rápido de entrada/saída (E/S) para identificar a melhor intensidade de estímulo. Forneça o pulso de estimulação projetado na etapa 3.5.1 a 0.2 Hz ou menos, adicionando um intervalo entre pulsos de 5 s ou mais na forma apropriada do software de controle de estímulo. Na guia de amplitude de pulso, insira uma amplitude de pulso inicial de 100 μA/fase e aumente em passos de 50 a 100 μA em cada tentativa até que a estimulação possa evocar de forma confiável eventos semelhantes à interictal nos córtices parahipocampais (verifique os sinais visualizados pelo software de gravação).
- Modulação elétrica da ictogênese límbica
- Programe a unidade de estímulo para fornecer o protocolo de estimulação de interesse. Utilizar a amplitude do estímulo identificada durante o teste de E/S.
nota: A taxa de falha das respostas evocadas deve ser de ≤20%.
- Após a interrupção da estimulação, verifique a recuperação da rede à condição pré-estímulo registrando pelo menos 4 descargas ictais (como na etapa 3.4).
