1. Construindo uma arena comportamental e preparando hardware para permitir a estimulação optogenética na arena comportamental
- Para construir uma arena de comportamento privado de luz, construa uma caixa com uma dimensão de 89 x 61 x 66 cm3 (35 "L x 24" W x 26 "H) feita de folhas de acrílico plexiglass de cor preta (3 mm de espessura) (ver Tabela de Materiais). Os materiais para construir essa caixa devem estar disponíveis em lojas de ferragens locais. Coloque esta caixa em uma mesa na sala de comportamento (Figura 1A).
- Monte uma câmera monocromática de dispositivo de carga acoplada (USB) 3.0 (barramento serial universal) 3.0 equipada com um filtro infravermelho (IR) de passagem longa de 830 nm e uma lente de montagem C F1.4 de 8 mm (consulte a Tabela de Materiais) no centro do teto da caixa preta. Coloque duas tiras de diodo emissor de luz infravermelha (LED) (consulte a Tabela de Materiais) no tampo da mesa para iluminar as larvas na arena escura (Figura 1A).
- Para construir a plataforma LED, obtenha uma placa de alumínio quadrada de 22 cm × 22 cm (de preferência pintada com spray com acabamento preto fosco para eliminar quaisquer reflexos). No centro da placa, usando um cortador de metal, faça um orifício grande o suficiente para caber ao redor da câmera CCD.
- Cubra a placa de metal com fitas de LED vermelhas (consulte a Tabela de Materiais). Solde os fios da tira de luz LED em série e alimente os fios da tira em um relé optoacoplador controlado por um microprocessador Raspberry Pi 2B (consulte a Tabela de Materiais) (Figura 1B e 2).
- Instale e configure o sistema operacional baseado em Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux no processador Raspberry Pi antes de conectar o relé optoacoplador às fitas de LED. Conecte uma fonte de alimentação para alimentar as tiras de LED e o optoacoplador (Figura 2) (consulte a Tabela de Materiais). Monte a plataforma de LED ao redor da câmera CCD (Figura 1B).
nota: O sistema operacional Ubuntu Mate v16.04 está disponível gratuitamente. Um conjunto de comandos simples baseados em Python pode ser facilmente adaptado aos padrões de programa de estímulos de luz LED (consulte o arquivo de sintaxe).
- Garanta irradiância homogênea em vários pontos da arena do comportamento. Meça a irradiância absoluta na superfície da arena com a ajuda de um espectrômetro e determine que seja ~1,3 W/m2 em toda a superfície da arena.
nota: Nessa intensidade, não foram observadas mudanças significativas na temperatura ao longo dos experimentos. Outro estudo usou uma irradiância mais alta de ~ 1,9 W / m2 e não observou mudanças na temperatura ao longo dos experimentos.
2. Preparação de larvas de Drosophila para análises comportamentais
- Mantenha as moscas em alimentos padrão para moscas (consulte a Tabela de Materiais) a 25 ° C, 50-60% de umidade relativa (UR) e um ciclo claro/escuro de 12 h / 12 h.
- Para expressar CsChrimson em um único par de ORNs, cruze fêmeas virgens de uma linha UAS-IVS-CsChrimson com machos de uma linha OrX-Gal4 ('X' corresponde a um dos 21 genes do receptor de odor larval (OR) que são expressos exclusivamente em cada um dos 21 pares de ORNs).
- Alternativamente, para expressar CsChrimson em todos os 21 ORNs larvais, cruze fêmeas virgens de uma linha UAS-IVS-CsChrimson com machos de uma linha Orco-Gal4 ('Orco' é o co-receptor expresso em todos os 21 ORNs).
- Use a linha UAS-IVS-CsChrimson sozinha como controle nesses experimentos.
nota: Os estoques de moscas listados aqui estão todos disponíveis no Bloomington Drosophila Stock Center (consulte a Tabela de Materiais).
- Uma vez que as moscas machos e fêmeas em um cruzamento possam acasalar e botar ovos por 48 horas, transfira os adultos para um frasco fresco.
- Na superfície do frasco para injetáveis contendo ovos, adicione 400 μL de uma mistura contendo 400 μM de all-trans retinal (ATR) dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) e 89 mM de sacarose dissolvido em água destilada.
nota: A pequena quantidade de sacarose promove a alimentação larval da solução ATR. ATR é um cofator necessário para a regulação positiva da expressão de CsChrimson. ATR é sensível à luz.
- Uma vez que o ATR é adicionado aos frascos de alimentos contendo ovos, incube os frascos no escuro por mais 72 h.
NOTA: Embora este estudo e os dois estudos acima não tenham observado efeitos no comportamento larval devido à alimentação com ATR, recomenda-se controlar os efeitos da alimentação com ATR submetendo as linhas de teste à mesma quantidade da mistura acima que não contém ATR.
- Extraia as larvas de terceiro ínstar (~ 120 h após a postura dos ovos) da superfície dos alimentos para moscas, flutuando-as usando uma solução de sacarose de alta densidade (15%). Usando uma micropipeta P1000, separar as larvas que flutuam na superfície da solução de sacarose em um copo de vidro de 1000 mL.
- Lave as larvas 3 a 4 vezes trocando 800 mL de água fresca destilada no copo de vidro de cada vez. Deixe as larvas descansarem por 10 minutos antes de submetê-las ao ensaio de comportamento.
3. Ensaio de Comportamento
- Mantenha temperatura (entre 22–25 °C) e umidade (entre 50 e 60% UR) consistentes na sala de comportamento.
- Prepare o meio rastejante larval despejando 150 mL de agarose derretida (1,5%) em uma placa de Petri quadrada de 22 cm x 22 cm. Uma placa de Petri é derramada para cada tentativa do ensaio, 8 a 10 tentativas por experimento. Deixe a agarose solidificar e esfriar por 1–2 h nas placas de Petri antes de usá-las no ensaio de comportamento.
- Transfira não mais do que 20 das larvas de terceiro ínstar preparadas para o centro da placa de Petri (Figura 1C). Cubra a placa de Petri com a tampa. Coloque a placa de Petri na arena de comportamento sob a câmera CCD.
nota: Dependendo do experimento, os ensaios de comportamento são normalmente realizados por 3 a 5 minutos. Se um odor for usado no ensaio para fornecer dicas de orientação, observou-se que o gradiente de odor resultante permanece estável por aproximadamente 5 min. Tempos de ensaio mais longos não são recomendados. Não foram observados efeitos deletérios nas larvas devido à desidratação ou à exposição prolongada à luz vermelha de 630 nm nesses pontos de tempo.
- Ligue a fonte de luz LED infravermelha de 850 nm para visualizar as larvas no vídeo. Inicie a câmera CCD para registrar o movimento larval
.
- Usando o software associado ao processador Raspberry Pi, programe o procedimento para administrar padrões apropriados de estimulação da luz vermelha.
nota: Um conjunto de comandos simples baseados em Python pode ser facilmente adaptado aos padrões de programa de estímulos de luz LED (consulte o arquivo de sintaxe).
