Inibição de correntes pós-sinápticas excitatórias mediada por microRNA em fatias de hipocampo de camundongo

Resumo

Fonte: Thalhammer, A., et al. Combinando optogenética com microRNAs artificiais para caracterizar os efeitos do knockdown de genes na função pré-sináptica dentro de circuitos neuronais intactos. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a inibição mediada por microRNA de correntes sinápticas excitatórias em fatias de cérebro de hipocampo de camundongos. Os neurônios CA3 foram infectados com um vetor viral recombinante que abriga uma construção para expressar um repórter fluorescente, um canal de membrana ativado por luz e um microRNA que regula negativamente a expressão de canais de cálcio dependentes de voltagem. Ao colocar uma fatia em uma câmara de gravação e remendar um neurônio CA1 com uma pipeta de gravação, pulsos de luz foram usados para estimular o canal ativado pela luz, resultando em um influxo de íons e gerando um potencial de ação. A ausência de canais de cálcio dependentes de voltagem nos neurônios CA3 inibe a liberação de neurotransmissores, causando inibição de correntes pós-sinápticas excitatórias nos neurônios CA1 conectados sinapticamente.

Protocolo

1. Avaliando o papel das proteínas pré-sinápticas em circuitos neuronais intactos por estimulação direcionada de neurônios derrubados com optogenética

NOTA: O protocolo a seguir requer experiência anterior com registros eletrofisiológicos em fatias cerebrais agudas e acesso a uma configuração eletrofisiológica.

1. Injete estereotaticamente o vírus adeno-associado recombinante com os sorotipos 1 e 2 do mosaico (rAAV1/2) no cérebro. Determine as coordenadas estereotáxicas para a região cerebral de interesse usando atlas estereotáxicos para cérebro de camundongo ou rato.
   1. Use um extrator de micropipeta para puxar micropipetas de injeção com hastes longas de Ø 7–9 μm; prenda as micropipetas de injeção nas hastes com uma tesoura. Use um marcador fino e papel milimetrado para colocar marcas de calibração nas micropipetas de injeção a cada 2 mm.
   2. Anestesiar o animal com isoflurano e fixá-lo no aparelho estereotáxico.
   3. Mantenha o animal aquecido durante toda a operação com uma almofada de aquecimento regulada para 37 °C.
   4. Proteja os olhos com lubrificante ocular.
   5. Raspe o pelo da cabeça com um barbeador elétrico.
   6. Espalhe iodopovidona na cabeça raspada usando um cotonete.
   7. Sob um microscópio de dissecação, faça uma incisão na linha média.
   8. Limpe a superfície do crânio com um cotonete, para tornar o bregma e o lambda visíveis.
   9. Coloque a micropipeta de injeção em seu suporte. Fixe o suporte ao braço estereotáxico.
   10. Determinar as coordenadas x e y do local da injeção em relação ao bregma e/ou ao lambda.
   11. Use uma broca para afinar o crânio sobre a área-alvo.
       nota: Use movimentos circulares suaves e evite perfurar o crânio, pois isso danificará a superfície do cérebro.
   12. Se houver sangramento, absorva o sangue em excesso com papel toalha.
       nota: O excesso de sangue dificultará a determinação correta da coordenada z.
   13. Carregue ≤2 μL de vírus na micropipeta de injeção por ação capilar.
   14. Traga a micropipeta de injeção para as coordenadas x e y do local da injeção.
   15. Calcule a coordenada z da dura-máter e abaixe a pipeta lentamente no cérebro.
   16. Quando a coordenada z for atingida, aguarde 3 min para permitir o ajuste do tecido.
   17. Aplique baixa pressão positiva usando uma seringa de 1 mL conectada por meio de um tubo flexível na parte traseira da micropipeta de injeção. Monitore visualmente a velocidade de ejeção do vírus da micropipeta de injeção através do microscópio de dissecção e usando as marcas de calibração como pontos de referência.
       nota: O vírus precisa ser injetado em baixa taxa (<100 nL/min) para evitar danos aos tecidos.
   18. Quando a injeção terminar, aguarde 5 min, retire a micropipeta de injeção em 0,2 mm, aguarde mais 5 min, para evitar o refluxo do vírus.
   19. Retire a micropipeta de injeção lenta e completamente do cérebro e descarte-a em um recipiente cheio de água sanitária.
   20. Molhe o crânio com solução fisiológica e suture a pele com 3-4 pontos.
   21. Aplique pomada de gentamicina na ferida.
   22. Alojar o animal em uma gaiola limpa com pellets de comida e sob uma lâmpada de calor até que ele se recupere totalmente.
2. ≥15 dias após a injeção, decapitar os animais sob anestesia profunda com isoflurano.
3. Prepare fatias cerebrais agudas da região cerebral de interesse com um vibratomo usando solução de líquido cefalorraquidiano artificial gelado (aCSF) gaseificada (95% O₂, 5% CO₂), contendo (em mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH₂PO₄, 1,5 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 piruvato de sódio e 18 glicose (osmolaridade ajustada para 300 mOsm). Por exemplo, se o objetivo é analisar a transmissão sináptica de neurônios piramidais CA3 para CA1, prepare fatias sagitais da formação hipocampal (350 μm de espessura).
   nota: A partir desta etapa, trabalhe em condições de pouca luz para evitar a ativação da sonda optogenética pela luz ambiental.
4. Deixar que as fatias recuperem durante 30 min a 37 °C no mesmo aCSF numa câmara concebida para conter fatias de cérebro. Mantenha os cortes na mesma câmara de fatias cerebrais em temperatura ambiente até a gravação.
   nota: Usando essas condições, as fatias podem ser mantidas saudáveis por até 6 a 8 h.
5. Transferir um corte para uma câmara de registro submersa e superfundi-lo com 2 mL/min do mesmo aCSF usado para recuperação suplementado com 1,5 mM de CaCl₂ (total de Ca²⁺: 2,5 mM) e sem piruvato de sódio.
   nota: As fatias são preparadas e mantidas em baixa concentração de Ca²⁺ (1 mM) para minimizar a toxicidade. Os registros são realizados em 2,5 mM de Ca²⁺ para favorecer a liberação da vesícula.
6. Verifique brevemente o sinal do repórter fluorescente expresso (p. ex. TdTomato; Figura 1B) para verificar a localização e intensidade da infecção.
7. Encha um eletrodo de adesivo com uma solução intracelular contendo (em mM): 110 K-gluconato, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 etilenoglicol-bis(β-éter aminoetílico)-N,N,N',N'-ácido tetracético (EGTA), 3 MgCl₂, 4 sal de adenosina 5'-trifosfato de magnésio (Mg-ATP), 0,5 Guanosina 5'-trifosfato sal trissódico (Na_3-GTP), 20 K₂-fosfato de creatina, 10 tampão de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico ajustado com KOH (HEPES-KOH, pH 7,28, 290 mΩ).
   nota: Use eletrodo de contato com uma resistência de pipeta de 5–6 mΩ.
8. Sob iluminação infravermelha, alcance a configuração de célula inteira hermeticamente fechada de um neurônio que recebe entradas sinápticas dos neurônios infectados. Por exemplo, se os neurônios piramidais CA3 foram infectados, coloque os neurônios piramidais no trato proximal ao medial da região CA1 (Figura 1C).
   nota: A resistência em série pode ser deixada sem compensação, mas deve ser constante e baixa (≤20 MΩ).
9. Use a farmacologia para isolar as correntes sinápticas sob investigação. Por exemplo, se o objetivo é investigar a transmissão sináptica excitatória, bloqueie a transmissão sináptica inibitória com 10 μM de bicuculina.
10. Evoque correntes sinápticas, por exemplo, correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSCs), usando um laser azul de 473 nm acoplado a uma fibra óptica (Ø ≤250 μm) posicionada na somata dos neurônios infectados (por exemplo, CA3 neurônios piramidais).
    1. Ajuste a duração da estimulação ao mínimo, para reduzir a possibilidade de evocar mais de um potencial de ação por pulso de luz. Se estiver usando ChETA, defina-o para 2 ms.
    2. Ajuste a força de estimulação do laser para produzir correntes sinápticas pequenas, mas claramente detectáveis (amplitude de pico de ≤50 pA para EPSCs registradas em um potencial de retenção de -70 mV entre neurônios piramidais CA3 e CA1; Figura 1D). Se estiver usando ChETA e uma fibra óptica de 250 μm de diâmetro, as forças de estimulação de 1 a 3 mW na saída da fibra devem ser adequadas.
       NOTA: se a intensidade do laser não puder ser regulada, use filtros de densidade neutra.
    3. Acenda a luz laser de 473 nm no somata dos neurônios infectados, mas não em seus axônios. Por exemplo, ilumine os somas CA3 e afaste-se das colaterais de Schaffer, para evitar a despolarização direta dos axônios.
    4. Aplique tetrodotoxina (TTX; 0,5 μM), um bloqueador dos canais de sódio, na amostra para confirmar que os canais são acionados pelo potencial de ação.
    5. Em diferentes gravações, aplique um bloqueador seletivo na corrente sináptica sob investigação para confirmar que a estimulação é seletiva.
       nota: Por exemplo, aplique EPSCs mediadas por receptor de glutamato do tipo ácido α-amino-6-nitro-7-sulfamoil-benzo [f] quinoxalina (NBQX, 10 μM) a EPSCs mediadas por receptor de glutamato do tipo ácido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico (AMPA).
    6. Compare as correntes sinápticas evocadas óptica e eletricamente na mesma fatia cerebral aguda em resposta à estimulação repetitiva (≥2 estímulos a ≤20 Hz). Um grau semelhante de facilitação ou depressão sináptica deve ser observado entre a estimulação elétrica e óptica quando se utiliza um microRNA controle (miR), sugerindo que mecanismos celulares semelhantes são ativados pelos dois tipos de estimulações.
       nota: As etapas acima são necessárias para garantir que a estimulação óptica não induza uma despolarização direta dos botões pré-sinápticos, ignorando assim alguns mecanismos de transmissão sináptica.

Resultados

Figura 1. Avaliando o papel de Ca_v2.1 [EFa] e Ca_v2.1 [EFb] no hipocampo nativo por estimulação direcionada de neurônios knock-down com optogenética. (A) Esquema do de expressão das construções rAAV usadas para infecção in vivo. (B) Seção do hipocampo mostrando que a fluorescência do TdTomato é limitada à região CA3 e suas projeções.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fatias de cérebro Pré-câmara	Aparelho de Harvard	BSC-PC
Gerador de imagens baseado em câmera CCD	Bio-Rad	ChemiDoc™ MP
Reagentes de cultura celular	Tecnologias da Vida
broca	Foredom	K.1030
EGTA	sigma	E4378
Pomada de gentamicina	Farmácia local
glicose	sigma	G7021
HEPES	sigma	Rolamento 54459
Micropipetas para injeção	Narishige	GD1
Sais e detergentes inorgânicos	sigma
K2-fosfato de creatina	Calbioquímica	237911
KGluconate	Fluka	Nº 60245
laser	Tecnologias Laserglow	LRS-0473-GFM-00100-03
membrana	Amersham	Protran™ 0,2 μm NC
MgATP	sigma	Resposta A9187
Porta-micropipetas	Narishige	IM-H1
Extrator de micropipetas	Narishige	PC-100
Na3GTP	sigma	G8877
NaPyruvate	sigma	Pág. 5280
Lubrificante ocular	Farmácia local	Lacrigel
Iodopovidona	Farmácia local	Betadine
Aparelho estereotáxico	WPI
Tetrodotoxina	Tocris	1069	tóxico
Vibratomo	Leica	VT1200S