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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Carregamento de corante de cálcio
- Selecione corantes de cálcio com base na preferência do pesquisador individual. Aqui usamos Fluo-8AM ou Fluo-4AM. No entanto, este método também pode ser aplicado a outros corantes: dissolver corantes de cálcio em DMSO em uma solução de 1 mM e copolímeros em bloco a 1% (por exemplo, ácido plurônico-127) até um volume final de 50 μL e sonicar por 10 min.
- Adicione a solução ao aCSF a uma concentração final de 10 μM, 0,01% de copolímeros em bloco para fatias de cérebro.
- Para animais adultos (>12 semanas), pipetar os corantes (50 μL) diretamente nas fatias de cérebro e manter por 75 min para permitir uma melhor penetração do corante nas camadas profundas.
- Para garantir a oxigenação adequada da fatia submersa durante a incubação do corante, prepare uma câmara de carregamento de vidro com tampa fechada (frasco circular de 2,5 cm de diâmetro, 3,5 cm de altura) com corantes de cálcio diluídos em 2,5 mL de aCSF. Oxigenar continuamente com 95% de O2/5% de CO2. Não borbulhe.
- Após o carregamento do corante, lavar o tecido com aCSF e transferi-lo para o sistema de incubação, reduzindo lentamente a temperatura para 15 - 16 °C até que esteja pronto para uso experimental.
2. Registros eletrofisiológicos e imagens
- Coloque o tecido em uma câmara de registro submersa sob um microscópio e perfunda com aCSF oxigenado a uma taxa de fluxo de 4 - 5 mL / min em RT (~ 22 ° C) ou temperatura fisiológica (~ 35 ° C). Segure o tecido no lugar usando uma "harpa" feita sob medida, feita de fios de náilon ou ouro esticados e colados em um pedaço de fio de ouro ou platina em forma de U.
- Para eletrofisiologia:
- Prepare pipetas de gravação de vidro borossilicato de 1,5 mm (1,19 mm de diâmetro interno) usando um extrator de micropipeta para obter uma resistência final de 5-6 MΩ.
- Encha a pipeta com 3 a 4 μL de solução interna e visualize as células sob contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) usando uma câmera CCD. A solução intracelular deve ser cuidadosamente adaptada a cada experimento para alcançar resultados experimentais.
- Posicione a pipeta mantendo a pressão positiva aplicada através de uma porta de sucção no porta-pipetas na membrana de uma célula usando um micromanipulador. Nenhuma raspagem prévia da membrana é necessária, pois o ILM foi removido da retina. Quando a pipeta estiver na célula, aplique uma leve pressão negativa na pipeta para obter uma vedação de gigaohm. Em seguida, rompa a membrana celular com uma breve quantidade de pressão negativa.
- Faça registros de pinça de corrente ou tensão de célula inteira usando técnicas padrão, conforme apropriado.
- Imagem de cálcio:
- Para um único comprimento de onda de excitação de Fluo-4, filtre a luz de excitação através de um filtro passa-banda de 460 - 490 nm e a luz emitida através de um filtro passa-banda de 515 - 550 nm. Use uma câmera digital de alta velocidade para uma gravação mais rápida e sensível. Adquira imagens conforme necessário.
- Meça as alterações na fluorescência em função do tempo em um único comprimento de onda (Fluo-4).