Testando conexões monossinápticas usando canais de sódio resistentes à tetrodotoxina e à tetrodotoxina

Resumo

Fonte: Zhang, X. et al., Examinando conexões monossinápticas em Drosophila usando canais de sódio resistentes à tetrodotoxina. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o teste de conexões monossinápticas usando uma mosca transgênica. A mosca tem canais de sódio resistentes à tetrodotoxina e canais ativados por luz vermelha em seus neurônios pré-sinápticos, que são optogeneticamente excitados para transmitir sinais aos neurônios pós-sinápticos.

Protocolo

1. Prepare moscas e identifique as linhas promotoras GAL4

1. Selecione uma linha promotora GAL4 e cruze-a com moscas portadoras do transgene UAS-NaChBac e de um transgene optogenético para ativação.
   nota: O UAS-CsChrimson é selecionado devido à sua alta condutância e à facilidade com que ativa os potenciais de ação mediados pelo canal de sódio resistente à tetrodotoxina (TTX) (NaChBac). Tanto o UAS-NaChBac quanto o UAS-CsChrimson estão disponíveis no Bloomington Stocks Repository.
2. Preparar totalmente trans retinal como solução-mãe em etanol (35 mM) e conservar a solução em congelador a -20 °C.
3. Misture 28 μL desse estoque em aproximadamente 5 mL de alimento em flocos de batata reidratado e adicione essa mistura ao topo de um frasco de meio convencional de Drosophila.
4. Crie moscas adultas expressando csChrimson em alimentos contendo 0,2 mM all-trans-retinal por 1–3 dias.

2. Preparar estoque TTX

1. Crie uma solução estoque de TTX 1 mM em água destilada ou deionizada. Armazene esta solução em uma geladeira de laboratório por vários meses. Verifique as políticas da instituição em relação ao armazenamento de TTX, pois muitas instituições classificam o TTX como uma substância perigosa ou controlada.

3. Prepare moscas para eletrofisiologia

1. Colete moscas adultas de 1 a 3 dias que são criadas na comida com totalmente trans-retinal.
2. Coloque as moscas em um frasco de cintilação de vidro. Coloque o frasco sobre gelo por 1 min para imobilizar as moscas.
3. Use uma pinça grossa para inserir uma mosca em uma câmara de gravação personalizada. A câmara consiste em um laser circular de 3 1/2" cortado em acrílico de 1/16". Corte um orifício de 3/4" no centro, onde uma folha personalizada é fixada com epóxi de 2 partes. A folha contém uma esperança de formato triangular na qual a mosca é inserida.
4. Aplique cera ou epóxi curável ultravioleta (UV) ao redor do animal para prendê-lo firmemente dentro da câmara de gravação.
5. Ilumine a preparação com uma fibra óptica pescoço de ganso para visualização sob um estereomicroscópio. Defina as fibras do pescoço de ganso para iluminação oblíqua, ajustando-as para que iluminem a mosca diretamente do lado.
6. Ajuste o nível de luz para a configuração mais baixa possível que ainda permita uma visualização clara da mosca. Essa intensidade de luz varia entre experimentos individuais.
   nota: Este protocolo pode ser adaptado usando um método de explante cerebral in situ.
7. Recupere a solução salina de gravação externa. A solução salina contém em mM: 103 cloreto de sódio, NaCl, 3 cloreto de potássio, KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoetano-ácido sulfônico, 8 trealose, 10 glicose, 26 bicarbonato de sódio, NaHCO₃, 1 di-hidrogenofosfato de sódio, NaH₂PO₄, 1,5 cloreto de cálcio, CaCl₂ e 4 cloreto de magnésio, MgCl₂ (ajustado para 270-275 mΩ). A solução salina é borbulhada com 95% de O₂/5% de CO₂ (carbogênio) e tem um pH ajustado para 7,3.
8. Coloque 4-6 gotas de solução salina de registro extracelular sobre a preparação da mosca. Neste ponto, aumente o nível de luz no microscópio de dissecção para melhor visibilidade.
9. Afie um fio de tungstênio usando eletrólise. Para fazer o fio, prepare uma solução saturada de nitrato de potássio, KNO₃ e aplique aproximadamente 20 V de corrente alternada (CA) enquanto mergulha a ponta do fio na solução 20 vezes por 100 ms cada até que a ponta esteja afiada. Use o fio de tungstênio afiado para remover a cutícula da cabeça da mosca e, assim, expor o cérebro.
10. Exponha ainda mais o cérebro, removendo a traqueia e os corpos de gordura que o cercam. Se acessar os lóbulos antenais, use um fio de tungstênio dobrado ou ferramenta semelhante para dobrar suavemente as antenas embaixo da câmara de gravação de folha para aumentar a visibilidade. Use uma pinça afiada para arrancar suavemente o revestimento glial que cobre a área de interesse onde as gravações serão feitas.
11. Transfira a câmara de registro para o equipamento de eletrofisiologia. Inicie imediatamente a perfusão com solução salina de gravação externa borbulhada com carbogênio para preservar o cérebro. O reservatório de solução salina é colocado acima do estágio do microscópio e é alimentado por gravidade para a preparação. Utilizar uma linha de vácuo e um balão Erlenmeyer de 2 L para recolher os resíduos salinos.

4. Obter gravação de célula inteira

1. Puxe as pipetas de remendo em um extrator de pipetas comercial. Consulte o manual para configurações para obter uma pipeta apropriada com uma resistência de ponta próxima a 7 mΩ.
2. Adicione 4 μL de solução de registro interna em uma pipeta de remendo. A solução salina interna consiste em 140 aspartato de potássio, 10 ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES), 4 trifosfato de adenosina de magnésio (MgATP), 0,5 hidrato de sal trissódico de guanosina 5'-trifosfato (Na₃GTP), 1 ácido tetracético de etilenoglicol (EGTA) e 1 cloreto de potássio (KCl) em mM.
3. Configure o patch clamp amplifier para gravação de células inteiras. Zere o deslocamento do amplificador e defina o amplificador para fornecer pulsos de teste. Aqui, um amplificador de grampo Patch 2.400 da AM Systems é usado.
4. Aplique pressão positiva através da pipeta e aproxime-se da célula. Use um micromanipulador para direcionar a pipeta e entrar em contato com a célula. Libere a pressão positiva. Defina o potencial de retenção da membrana para -60 mV. A pipeta deve formar uma vedação de gigaohm com a membrana da célula, conforme evidenciado por uma corrente de retenção de sub-picoampere baixa.
   nota: Se estiver usando o direcionamento celular guiado por proteína fluorescente verde (GFP), tente minimizar o uso de luz epifluorescente para evitar a ativação de ChR2 e potencial depressão sináptica. Aguarde também alguns minutos antes de aplicar a etapa 5.
5. Defina o amplifier para fornecer pulsos de teste de -50 mV a -60 mV. Esta configuração é padrão em amplificadores patch-clamp. Os pulsos de teste revelarão um grande transiente capacitativo representando a corrente necessária para carregar a pipeta de remendo. Remova os transientes capacitativos ajustando os botões de compensação de capacidade no AM 2400 ou similar amplificador.
6. Aplique breves pulsos de pressão negativa para romper a membrana celular e obter a configuração de toda a célula.
   nota: Uma configuração celular inteira é observada quando há um grande aumento nos transientes capacitativos mostrando a capacitância do neurônio. Um pequeno aumento na corrente de retenção (linha de base) provavelmente também será observado. Defina o amplificador para o modo de grampo de corrente e ajuste o potencial da célula para -50 a -60 mV.

5. Testar a conectividade sináptica

1. Configure o sistema de aquisição de dados (DAQ) para acionar um driver de diodo emissor de luz (LED) para gerar pulsos de luz. Aqui, um sistema DAQ da National Instruments é usado com o Matlab para fornecer um sinal analógico a um driver de LED. A intensidade do LED é ajustada através do sinal analógico para o motorista. O LED é um LED de comprimento de onda de 620-630 nm.
2. Posicione o LED vermelho de alta potência diretamente abaixo da preparação. Ajuste a intensidade da luz para que 0,238 mW/mm² atinja a mosca.
3. Ative os neurônios pré-sinápticos durante a gravação da célula pós-sináptica de interesse. Alcance a ativação celular optogeneticamente, farmacogenicamente ou por meio de estimulação nervosa. Aqui, csChrimson e breves pulsos de luz vermelha são aplicados.
   NOTA: As conexões sinápticas podem ser monitoradas no grampo de corrente como potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSPs) ou no grampo de tensão como correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSCs). Uma conexão sináptica deve ser visível antes da aplicação do TTX em resposta a um pulso de luz de 40 ms. Se nenhuma conexão for observada, é improvável que os neurônios estejam sinapticamente conectados mono ou polissinapticamente. O potencial de retenção pode ser ajustado para enfatizar as conexões excitatórias ou inibitórias de acordo.
4. Se for observada uma conexão em solução salina normal, adicione TTX ao sistema de perfusão para atingir uma concentração final de 1 μM. Use uma bomba de recirculação para capturar e reutilizar a solução salina para conservar o TTX. A bomba peristáltica retirará a solução salina do banho e a devolverá ao reservatório de solução salina.
5. Ajuste a velocidade da bomba para fornecer um vácuo forte e constante que não permita que o nível de solução salina no banho suba e desça.
   nota: A aplicação de TTX deve resultar na cessação da atividade de pico no neurônio que está sendo monitorado em toda a célula. Isso confirma que TTX suficiente foi adicionado à solução salina.
6. Aplique breves pulsos de luz vermelha (40 ms para cada pulso) novamente. Neste ponto, qualquer conexão sináptica que permaneça é provavelmente monossináptica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
UAS-csChrimson	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	Rolamento 55135	Usado como ativador neural
UAS-NaChBac	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington	Nº 9466	Excitabilidade dos resótores em células em TTX
Tetrodotoxina	Tochris	1078	Pode ser necessária permissão especial para comprar TTX, pois é uma substância controlada
todos trans-retinianos	Sigma-Aldrichall trans-Retinal	R2500	Requer cofator para channelrhodopsin
Chapa de aço inoxidável 321 soldável, 0,002 "de espessura, 10" de largura	McMaster Carr	3254K7	Usado para fazer suporte de mosca personalizado. A folha personalizada pode ser cortada a laser a pololu.com a partir do arquivo PDF fornecido
Microscópio de dissecção	Zeiss	Stemi 2000-C	Usado para dissecação de preparação
Waxer	Almore	Encerador Eectra 66000	Usado durante a dissecação para proteger a mosca na folha
parafina	Joann	4917217	Usado com cera
Fórceps número 5	Ferramentas de Belas Ciências	#5CO	Usado para dissecação e desguarnição
Tesoura de dissecção	Ferramentas de Belas Ciências	15001-08	Usado para remover partes da cutícula durante a dissecção
Fio de tungstênio	Sistemas A-M	Rolamento 797500	Use com eletrólise para fazer agulhas afiadas para dissecação
Bomba peristáltica reciculante	Simplesmente Bombas (Amazon)	PM200S	para recirculação TTX
Controlador de velocidade para bomba peristáltica	Zitrades (Amazon)	N/A	Controlador de Dimming PWM Para Luzes LED ou Fita, 12 Volts 8 Amp, Interruptor de Luz de Brilho Ajustável Controlador de Dimmer DC12V 8A 96W para Led Strip Light B
Regulador de ar comprimido de precisão Versa-Mount	McMaster Carr	1804T1	Para aplicar pressão positiva durante o patch
Copos de vidro	Instrumentos de precisão mundiais	TW150F-3	Para pipetas de conexão
Medidor multiuso	McMaster Carr	3846K431	Manômetro para regulador de pressão
Câmera de eletrofisiologia	Dage MTI	IR-1000	Qualquer câmera que funcione na faixa de infravermelho (850 nm) funcionará. Você não deseja usar iluminação vermelha, pois isso pode ativar csChrimson
LED IR	Thorlabs	M850F2	Para iluminação oblíqua
Fibra óptica para LED IR	Thorlabs	M89L01	Casais com LED IR
Lente objetiva	Olympus 40X	LUMPlanFLN	Isso pode ser usado na maioria dos microscipes e funciona bem para visualizar neurônios de moscas.
LED âmbar	Thorlabs	M590L3d	Para visualizar RFP e mCherry
LED azul	Thorlabs	M470L3d	Para visualizar GFP
Conjunto de filtros GFP	Chroma	Nº 49011	Para visualizar GFP ou estimular channel2rhodopsin
Conjunto de filtros mCherry personalizados	Chroma	ET580/25X e T600LPXR (do conjunto 49306), mas com uma barreira ET610LP/óptica de emissão	Use apenas se desejar corrigir neurônios identificados com channel2rhodopsin
Dicróico para combinar LED âmbar e azul	Thorlabs	DMLP550R	Use apenas o adesivo sob mCherry e excite o channel2rhodopsin com luz azul.
LED vermelho	Fornecimento de LED	Cree XPE 620 – 630 nm	Usado para conduzir csChrimson
Driver de LED	Fornecimento de LED	3021-D-E-1000	Usado para acionar LEDs para estimulação optogenética
manipulador	Instrumentos Sutter	MP-225	Usado para posicionar a pipeta durante as gravações
Amplificador Patchclamp	Sistemas A-M	Modelo 2400	Um amplificador equivalente é adequado
Filtro de Bessel	Warner Instruments	LPF 202A	Filtro auxiliar usado para filtrar o traço de corrente para o osciloscópio durante o patching.
Sistema de aquisição de dados	Instrumentos nacionais	NI PCIe-6321 781044-01	Usado para gravar dados do amplificador para o computador
Bloco de conectores - Terminal BNC BNC-2090A	Instrumentos nacionais	Nº 779556-01	Usado para conectar o amplificador à placa DAQ.
Folha de aço	McMaster Carr	3254K7	Folha de aço para câmara de gravação personalizada
Ímãs	K&J Magnetics	D42	Para prender a câmara de gravação ao suporte do anel
1/16" Célula Fundida Acrílico Transparente	Pololu		Usado para fazer câmara de gravação personalizada. O acrílico pode ser cortado a laser a pololu.com a partir do arquivo PDF fornecido